氧化石墨烯納米支架培養(yǎng)臍源性MSC調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)微環(huán)境對軟骨的修復(fù)作用

劉愛峰， 王 平， 張 超， 張君濤， 鞏樹偉， 陳繼鑫

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis, KOA）是中老年人的常見病、多發(fā)病，隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的加劇，該病將來會(huì)成為困擾中老年人群的主要疾病之一[1]，因此對該病研究非常有意義。雖然當(dāng)前中西醫(yī)的臨床治療方法眾多，但均不能根除疾病[2]，即使臨床癥狀可以得到緩解，但患者也無法擺脫向晚期發(fā)展的最終趨勢，而對保守治療效果不理想的患者，大多只能通過手術(shù)的方式進(jìn)行治療[3]，而手術(shù)治療具有創(chuàng)傷大、風(fēng)險(xiǎn)高、費(fèi)用高的問題。目前很多研究集中在膝關(guān)節(jié)軟骨的再生與修復(fù)上，通過前期的研究發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯（graphene oxide, GO）顆粒潤滑劑能通過潤滑作用促進(jìn)KOA軟骨細(xì)胞的修復(fù)，而臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSC）是目前研究的熱點(diǎn)，其具有定向分化的潛能。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明將GO注射于大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)后，其心臟、肝臟和腎臟的病理均未見異常，也沒有發(fā)現(xiàn)病理滲出液，說明GO對大鼠未發(fā)生肝腎功能損害及組織損傷。且本實(shí)驗(yàn)前期通過體外培養(yǎng)已經(jīng)證實(shí)了GO與UCMSC的生物相容性，并且初步探索了適宜的劑量濃度，通過關(guān)節(jié)腔注射的方式也安全易操作。本研究利用GO顆粒潤滑劑搭載UCMSC來改善KOA關(guān)節(jié)腔內(nèi)的局部微環(huán)境，通過利用不同方法制備的KOA動(dòng)物模型驗(yàn)證其有效性，以期為治療KOA尋求新方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備 GO顆粒、UCMSC、透明質(zhì)酸(HA)、一氧化氮（NO）檢測試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子（TNF）-α試劑盒、GAG試劑盒、COL-II試劑盒(美國CCC公司)；Micro-CT（德國Siemens公司），離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。實(shí)驗(yàn)所選用的動(dòng)物均來自天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的12周雄性新西蘭兔64只（SCXK津2016-0001），體質(zhì)量2kg左右，培養(yǎng)環(huán)境為清潔級。1.2 GO與UCMSC的體外共培養(yǎng)

1.2.1 GO與UCMSC的生物相容性 觀察GO對UCMSC的細(xì)胞毒性，具體方法為：取P3代UCNSC細(xì)胞和GO固體顆粒，并進(jìn)行分組培養(yǎng)觀察，對照組為單純UCMSC培養(yǎng)組，UCMSC濃度均為5.0×105MSC/mL；實(shí)驗(yàn)組為UCMSC+GO聯(lián)合培養(yǎng)組，細(xì)胞濃度同樣為5.0×105MSC/mL；GO顆粒質(zhì)量為5 mg，相對混勻后接種到24孔板。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，連續(xù)觀察并拍照記錄。

1.2.2 UCMSC與不同濃度GO的體外培養(yǎng) 將濃度為8.0×104/mL的UCMSC分別與濃度為30 mg/mL、10 mg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、30 μg/mL、15 μg/mL的 GO 納 米顆粒進(jìn)行體外培養(yǎng)，取P3代臍帶UCMSC與GO混合后接種到24孔板，每孔接種密度為5.0×104/mL，每個(gè)濃度平行接種3孔。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，連續(xù)觀察并拍照記錄。

1.2.3 不同濃度UCMSC與GO的體外培養(yǎng) 將濃度分別為8×104/mL、4×104/mL、2×104/mL的UCMSC分別與濃度為30 μg/mL的GO納米顆粒進(jìn)行體外培養(yǎng)，取P3代臍帶UCMSC與GO混合后接種到12孔板，每孔接種100 μL，每個(gè)濃度平行接種4孔。在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，連續(xù)觀察并拍照記錄。

1.2.4 UCMSC與GO顆粒潤滑劑的體外共培養(yǎng)UCMSC接種密度2×105/mL，GO顆粒潤滑劑選用混合濃度為15 μg/mLGO+0.5%HA與30 μg/mLGO+0.25%HA；24孔板每孔接種1 mL；在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，連續(xù)觀察并拍照記錄。觀察GO顆粒潤滑劑對UCMSC體外存活影響的情況：UCMSC濃度為5×106/mL，分別接種于無培養(yǎng)基的普通培養(yǎng)皿中，一組添加生理鹽水5 mL，另一組添加30 μg/mLGO+0.25%HA的GO顆粒潤滑劑5 mL，室溫下過夜培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)UCMSC的存活率。

1.3 實(shí)驗(yàn)造模 通過改良Hulth+軟骨缺損以及改良木瓜蛋白酶控釋劑注射的方法建立KOA動(dòng)物模型[4-5]，具體造模方法如下：

1.3.1 改良Hulth+軟骨損傷模型 將動(dòng)物稱重后以水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉，然后進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)的備皮、消毒，將其仰臥于手術(shù)臺(tái)上，固定四肢。在無菌條件下取右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約2 cm，逐層切開顯露膝關(guān)節(jié)腔，然后切斷前交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，制作關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型。利用3.5 mm直徑圓形打孔器對暴露的股骨內(nèi)側(cè)髁表面軟骨制作圓形軟骨缺損區(qū)域（直徑3.5 mm，深度3 mm）。生理鹽水沖洗并取出破碎軟骨組織后，縫合傷口。術(shù)后每只動(dòng)物給予4U慶大霉素1 mL，連續(xù)3 d預(yù)防感染。術(shù)后不固定傷肢，自由活動(dòng)及進(jìn)食。

1.3.2 改良木瓜蛋白酶控釋劑模型 將動(dòng)物稱重后以水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉，將35%濃度的帕洛沙姆作為載藥體加載4%的木瓜蛋白酶，制備成溫敏型原位凝膠控釋注射劑，注射劑量標(biāo)準(zhǔn)按0.05 mL（1.6U）/關(guān)節(jié)。將注射劑從實(shí)驗(yàn)兔的右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)或外側(cè)間隙進(jìn)入，回抽無血性液體后將木瓜蛋白酶混合液注射入膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。將完成注射后的實(shí)驗(yàn)兔的雙膝關(guān)節(jié)及以下部分放入自制加熱箱內(nèi)，箱內(nèi)溫度控制在50 ℃，加熱時(shí)間為2 h。加熱期間，注意箱內(nèi)溫度計(jì)溫度，始終保持在50 ℃左右，同時(shí)保證雙膝關(guān)節(jié)以上的部分不受到加熱影響。2 h后造模結(jié)束，將實(shí)驗(yàn)兔取出，自由活動(dòng)，正常食水。.

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 本研究設(shè)計(jì)遵循實(shí)行“3R原則”包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的替代、減少和優(yōu)化原則。利用改良Hulth+軟骨缺損以及改良木瓜蛋白酶控釋劑注射兩種不同方法建立兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，分別為改良Hulth+軟骨缺損組，共制作32只，以軟骨損傷為主要病理表現(xiàn)，繼發(fā)關(guān)節(jié)內(nèi)炎性改變。另一組為改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組，同樣制作32只，以軟骨細(xì)胞變性壞死，進(jìn)而誘發(fā)關(guān)節(jié)內(nèi)炎性改變。

以上兩組動(dòng)物共計(jì)64只，造模過程順利，沒有出現(xiàn)動(dòng)物死亡情況。每組32只動(dòng)物模型，分為空白對照組8只，治療實(shí)驗(yàn)組24只。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)治療方法的不同將實(shí)驗(yàn)組分為3組：GO顆粒治療組（GO組）、UCMSC治療組（UCMSC組）、GO顆粒載UCMSC治療組（GO+UCMSC組），每組各8只。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 治療方法 GO組利用1 mL注射器于動(dòng)物模型的右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5 mL的GO顆粒潤滑劑，濃度為30 μg/mLGO+0.25%HA；UCMSC組利用1 mL注射器于動(dòng)物模型的右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5 mL的UCMSC，濃度為5×106個(gè)細(xì)胞/mL；GO+UCMSC組利用1 mL注射器于動(dòng)物模型的右膝關(guān)節(jié)腔注射0.5 mL的GO顆粒潤滑劑搭載UCMSC混合懸液，GO顆粒潤滑劑濃度為30 μg/mLGO+0.25%HA，UCMSC濃 度 為 5×106個(gè)細(xì)胞/mL。

1.5.2 操作方法 關(guān)節(jié)腔注射時(shí)首先用移液器從實(shí)驗(yàn)前期制備好的GO顆粒劑、UCMSC及GO顆粒劑搭載UCMSC混合懸液中抽取并分裝至各組1 mL注射器中，操作過程中注意注射液、無菌槍頭及無菌注射針頭不要被污染。然后利用動(dòng)物固定架將動(dòng)物固定，助手將右髖關(guān)節(jié)外展外旋以暴露膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，同時(shí)屈曲右膝關(guān)節(jié)90°左右，操作者對膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)區(qū)域進(jìn)行碘伏消毒。最后操作者從右膝脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)上方1 cm左右處進(jìn)針，阻力感消失后進(jìn)行注射。在操作期間，助手要注意對動(dòng)物右下肢的固定力度不要過大，以免造成損傷，如果動(dòng)物肌肉緊張明顯，可以先行0.25%的利多卡因0.1 mL局部浸潤麻醉。

1.5.3 治療周期 所有關(guān)節(jié)腔注射治療均為1次，改良Hulth+軟骨缺損組造模后1個(gè)月開始治療，治療觀察期8周，改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組造模后1周開始治療，治療觀察期8周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清學(xué)指標(biāo)檢測 治療8周后，在無菌條件下分別抽取兩組實(shí)驗(yàn)KOA動(dòng)物模型耳緣靜脈血5 mL，注入肝素化離心管中，以3000 r/min離心10 min收集血清，于-20 ℃保存。采用ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法[6]檢測血清IL-6、TNF-α、NO、糖胺聚糖（GAG）和II型膠原蛋白（COL-II）的含量。

1.6.2 病理學(xué)檢測 空氣栓塞法處死動(dòng)物，取完整右膝關(guān)節(jié)，去除周圍皮膚、肌肉，暴露股骨髁軟骨退變?nèi)睋p區(qū)域，切片，包埋，進(jìn)行HE染色病理學(xué)檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用表示，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GO與UCMSC的體外共培養(yǎng)情況

2.1.1 UCMSC與GO顆粒體外培養(yǎng)情況UCMSC與GO與共培養(yǎng)24 h，UCMSC正常生長，GO沒有引起UCMSC細(xì)胞的大量死亡，GO顆粒開始聚集成團(tuán)，UCMSC細(xì)胞有向GO聚集的傾向，并將GO顆粒逐步包裹起來（圖1）。

UCMSC與GO與共培養(yǎng)72 h，UCMSC正常生長，GO沒有引起UCMSC細(xì)胞的大量死亡，觀察到UCMSC細(xì)胞進(jìn)一步向GO聚集的傾向，并向GO顆粒攀爬將其包裹成團(tuán)，UCMSC開始立體生長，并刺激增殖（圖2）。UCMSC與GO與共培養(yǎng)7 d，UCMSC正常生長，GO沒有引起UCMSC細(xì)胞的大量死亡，觀察到UCMSC細(xì)胞基本全部向GO聚集，將GO顆粒嚴(yán)密包裹起來，形成GO+UCMSC的集團(tuán)結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖1 UCMSC與GO共培養(yǎng)24h（×40）

圖2 UCNSC與GO共培養(yǎng)72h（×40）

圖3 UCMSC與GO共培養(yǎng)7 d

2.2 血清NO檢測結(jié)果 組內(nèi)比較：改良Hulth+軟骨缺損組中，GO+UCMSC組血清NO平均值（17.624±0.127）低于空白組（22.097±0.352），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組血清NO平均值（21.020±0.026）與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.064），GO組血清NO平均值（21.436±0.031）與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.1925），GO+UCMSC組與UCMSC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組中，GO+UCMSC組血清NO平均值（17.799±0.049）低于空白組（23.662±0.056），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組血清NO平均值（19.424±0.046）與GO組血清NO平均值（20.544±0.085）均低于空白組（P<0.05）；GO+UCMSC組低于UCMSC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組間比較：GO+UCMSC組、UCMSC組比較及GO組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029），見圖 4。

圖4 治療后血清NO結(jié)果（ng/mL）

2.3 血清COL-II檢測結(jié)果 組內(nèi)比較：改良Hulth+軟骨缺損組中，GO+UCMSC組血清COL-II平 均 值（19.372±0.063） 高 于 空 白 組（13.475±0.342），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組血清COL-II平均值（15.589±0.063）高于空白組（P<0.01），GO組血清COL-II平均值（14.127±0.102）與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；GO+UCMSC組高于UCMSC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組中，GO+UCMSC組血清COL-II平均值（16.257±0.416）高于空白組（12.253±0.147），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組血清COL-II平均值（14.429±0.092）與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），GO組血清COL-II平均值（13.644±0.028）與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P>0.05）；GO+UCMSC組 與 UCMSC組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。組間比較：GO+UCMSC組比較、UCMSC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），GO組比較、空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖5。

2.4 血清GAG檢測結(jié)果 組內(nèi)比較：改良Hulth+軟骨缺損組中，GO+UCMSC組血清GAG平均值（37.439±2.155）高于空白組（23.832±0.891），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組血清GAG平均值（29.022±0.973）高于空白組（P<0.05），GO組血清GAG平均值（26.342±1.042）與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；GO+UCMSC組高于UCMSC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組中，GO+UCMSC組血清GAG平均值（26.554±0.450）高于空白組（18.709±0.552），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組血清GAG平均值（24.028±0.675）高于空白組（P<0.01），GO組血清GAG平均值（22.689±0.641）高 于 空 白 組（P<0.05）；GO+UCMSC組 高 于UCMSC組（P<0.05）。組間比較：GO+UCMSC組比較、空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組比較、GO組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖6。

2.5 血清IL-6檢測結(jié)果 組內(nèi)比較：改良Hulth+軟骨缺損組中，GO+UCMSC組血清IL-6平均值（7.426±0.294）低于空白組（16.082±0.323），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組血清IL-6平均值（9.668±0.194）低于空白組，GO組血清IL-6平均值（10.957±0.343）低于空白組；GO+UCMSC組低于UCMSC組（P<0.01）。改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組中，GO+UCMSC組血清IL-6平均值（8.680±0.242）低于空白組（18.367±0.861），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組 血 清 IL-6平 均 值（9.506±0.123）低于空白組（P<0.01），GO組血清IL-6平均值（10.002±0.191） 低 于 空 白 組（P<0.01）；GO+UCMSC組低于UCMSC組（P<0.05）。組間比較：GO+UCMSC組比較、空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），UCMSC組比較、GO組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖7。

圖5 治療后血清COL-II結(jié)果（ng/mL）

圖6 治療后血清GAG結(jié)果（ng/mL）

圖7 治療后血清IL-6結(jié)果（ng/mL）

2.6 血清TNF-α檢測結(jié)果 組內(nèi)比較：改良Hulth+軟骨缺損組中，GO+UCMSC組血清TNF-α平均值（5.139±0.183）低于空白組（9.466±0.177），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組 血 清 TNF-α 平 均 值（6.109±0.044） 低 于空 白 組（P<0.01），GO 組 血 清 TNF-α 平 均 值（8.447±0.113） 低 于 空 白 組（P<0.01）；GO+UCMSC組低于UCMSC組比較（P<0.01）。改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組中，GO+UCMSC組血清TNF-α平均值（6.210±0.058）低于空白組（10.013±0.197），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），UCMSC組血清TNF-α平均值（6.856±0.160）低 于 空 白 組（P<0.01），GO 組 血 清 TNF-α 平均值（8.891±0.188）低于空白組（P<0.01）；GO+UCMSC組低于UCMSC組（P<0.05）。組間比較：GO+UCMSC組、空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），UCMSC組比較、GO組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖8。

2.7 HE病理學(xué)檢測結(jié)果 使用HE染色股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨，發(fā)現(xiàn)A組軟骨缺損程度及范圍較B組呈現(xiàn)明顯、加重趨勢，損傷區(qū)域可累及整個(gè)關(guān)節(jié)軟骨，并且主要累及中層及深層。B組關(guān)節(jié)軟骨缺損呈現(xiàn)不規(guī)則分布，此時(shí)染色減少，往往伴隨著局部細(xì)胞數(shù)量的減少，兩組比較有明顯差異。

在改良Hulth+軟骨缺損組中，UCMSC+GO、UCMSC、GO、空白組的軟骨修復(fù)效果呈梯度降低，其中UCMSC+GO組修復(fù)效果最好，軟骨厚度最厚，與周圍軟骨接觸較緊密，并且軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)一定的分層趨（圖9）勢。在改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組中，UCMSC+GO、UCMSC、GO、空白組的軟骨修復(fù)效果呈梯度降低，其中UCMSC+GO組修復(fù)效果最好，軟骨厚度最厚，與周圍軟骨接觸較緊密，并且軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)一定的分層趨勢（圖10）。

圖9 改良Hulth+軟骨缺損組病理組織學(xué)觀察結(jié)果（HE染色×40）

圖10 改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組病理組織學(xué)觀察結(jié)果（HE染色×40）

3 討論

3.1 軟骨修復(fù)對微環(huán)境改善 關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)是KOA近些年研究的熱點(diǎn)，只有軟骨得到有效修復(fù)才能說明對該病進(jìn)程的實(shí)質(zhì)性改變。隨著近年來隨著干細(xì)胞技術(shù)的逐步成熟，關(guān)于干細(xì)胞介導(dǎo)人體組織損傷修復(fù)的研究甚至是臨床報(bào)道越來越多，而UCMSC作為組織工程中理想的種子細(xì)胞已經(jīng)被證實(shí)具有修復(fù)軟骨的能力。Bastos等[7]利用KOA患者自體髂骨骨髓提取培養(yǎng)的BMSC進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射治療，觀察12個(gè)月后發(fā)現(xiàn)患者的膝關(guān)節(jié)癥狀及關(guān)節(jié)功能都有明顯改善。KOA的發(fā)病從根本上來說還是力學(xué)環(huán)境改變引起軟骨損傷，所以力學(xué)因素是比較關(guān)鍵的兩方面，由于MSC不能對關(guān)節(jié)軟骨表面產(chǎn)生力學(xué)干預(yù)。GO具有很好的生物相容性和安全性，通過前期研究發(fā)現(xiàn)其可以在關(guān)節(jié)面形成一層保護(hù)層，改變軟骨表面的摩擦系數(shù)。GO屬于石墨烯的衍生物，是由天然石墨經(jīng)強(qiáng)氧化劑氧化而來的一種層狀納米級材料，其表面具有大量的含氧官能團(tuán)，有著良好的生物相容性[8]，還能夠通過靜電等作用與蛋白質(zhì)相結(jié)合，因此GO一直被廣泛應(yīng)用到藥物或蛋白的傳遞、生物傳感器及組織再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[9-11]。通過本研究發(fā)現(xiàn)單純的GO也能降低兩種KOA動(dòng)物模型中血清中的IL-6和TNF-α，降低其炎癥反應(yīng)。UCMSC具有來源廣泛、取材安全方便、不違反倫理原則、低免疫源性、高增殖與多能分化等特性等優(yōu)勢[12]。通過本研究發(fā)現(xiàn)UCMSC能降低兩種KOA動(dòng)物模型中血清中的IL-6和TNF-α，降低其炎癥反應(yīng)，而且能降低血清中GAG的含量促進(jìn)軟骨的修復(fù)。本研究將GO顆粒潤滑劑與UCMSC聯(lián)用，GO顆粒潤滑劑形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)支架，具有更大的接觸表面積，可以將UCMSC牢牢吸引在自身周圍，并讓其在自身支架結(jié)構(gòu)中黏附、伸展、存活、增殖，在低濃度HA的作用下均勻分布，制備成一種良好的復(fù)合結(jié)構(gòu)，可以用于關(guān)節(jié)腔內(nèi)封閉環(huán)境的治療，在改善潤滑環(huán)境的同時(shí)，又可以發(fā)揮MSC的調(diào)節(jié)免疫作用來改善生化微環(huán)境[13]，并且MSC還可以一定程度上修復(fù)損傷的組織結(jié)構(gòu)[14]。這有說明臨床醫(yī)生力求恢復(fù)關(guān)節(jié)力學(xué)平衡和解剖結(jié)構(gòu)，然后生物學(xué)才能發(fā)揮作用。

3.2 退行性骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型干預(yù)效果 本實(shí)驗(yàn)建立選擇兩種KOA動(dòng)物模型，改良Hulth+軟骨缺損組的改良Hulth+軟骨缺損模型主要運(yùn)動(dòng)損傷模型，針對目前多發(fā)韌帶撕裂、半月板破壞等，這種損傷會(huì)引起關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)逐漸發(fā)展成為KOA，研究結(jié)果說明該類GO顆粒的三維網(wǎng)狀支架作用就比較重要，可以讓UCMSC更好地黏附著在軟骨缺損區(qū)域，從而生長與增殖。可以讓UCMSC更好地附著在軟骨缺損區(qū)域。改良木瓜蛋白酶控釋劑關(guān)節(jié)注射組模型屬于化學(xué)因子誘導(dǎo)的軟骨退變模型，可見軟骨不同程度的壞死，比較接近臨床中退行性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果兩組 中 GO+UCMSC組 血 清 NO、COL-II、GAG、IL-6、TNF-α與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也說明利用GO顆粒潤滑劑搭載UCMSC對其有較好的治療效果[15]。氧化石墨烯載UCMSC能促進(jìn)兩種KOA動(dòng)物模型軟骨細(xì)胞分泌，降低關(guān)節(jié)內(nèi)炎性水平，起到軟骨修復(fù)作用。固態(tài)潤滑改善力學(xué)微環(huán)境，干細(xì)胞干預(yù)改善生物學(xué)微環(huán)境，共同作用對兩種動(dòng)物模型均起到很好的修復(fù)效果，間接為臨床上兩種損傷模式所致的退行性骨關(guān)節(jié)炎治療提供診治思路[16]。

GO顆粒潤滑劑搭載UCMSC是結(jié)合了二者的優(yōu)勢，建立比傳統(tǒng)支架搭載系統(tǒng)的一種新的組織工程研究，但本研究尚屬于初步探索階段，目前只證明GO顆粒潤滑劑搭載UCMSC的生物相容性以及對KOA動(dòng)物模型軟骨修復(fù)作用，且沒有發(fā)生不良反應(yīng)，研究還存在許多不足及需要深入的地方。本實(shí)驗(yàn)中將氧化石墨烯顆粒注射于膝關(guān)節(jié)腔后，本應(yīng)可在股骨髁大體觀察中看到GO黑色顆粒，但并未觀察到GO顆粒，說明GO在關(guān)節(jié)腔內(nèi)進(jìn)行了代謝，此為今后研究的重點(diǎn)。