淫羊藿對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療機(jī)制研究

王 東， 梅婷婷， 楊關(guān)根， 裘建明， 傅 超， 邵書先， 袁玥旻， 肖石梅

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種有終生復(fù)發(fā)傾向的腸道慢性非特異性炎癥疾病，其病因十分復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其是一種自身免疫相關(guān)性疾病[1-2]。由于UC反復(fù)發(fā)作，病情嚴(yán)重程度不等，近年來已成為危害人們身體健康的主要腸道疾病之一[3-4]。淫羊藿作為我國傳統(tǒng)中草藥，研究顯示其具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌免疫、促進(jìn)代謝、抗氧化、延緩衰老等功能，特別是其免疫調(diào)節(jié)作用近年來成為研究的熱點(diǎn)。本研究采用大鼠UC模型，通過多項(xiàng)指標(biāo)觀察淫羊藿對UC的治療效果，并探討其治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性成年SD大鼠（體質(zhì)量180～210 g）84只，在屏障環(huán)境下飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室使用許可證編號：SYXK（蘇）2016-0014，動物合格證號：NO201801110023。動物飼養(yǎng)用飼料為鈷60輻射滅菌過的大小鼠專用顆粒飼料（江蘇省協(xié)同生物科技有限公司）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，恒溫（23±2）℃，恒濕（50±10）%，晝夜循環(huán)。

1.2 主要試劑和儀器 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）、DAB及二甲苯購自國藥集團(tuán)；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)所用免疫組化切片機(jī)、病理組織烘漂儀、脫水機(jī)及包埋機(jī)（BMJ-B 型）均購自常州中威電子儀器；光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社。

1.3 藥物及提取方法 遼寧朝鮮淫羊藿飲片由杭州市第三人民醫(yī)院藥劑科提供，取生淫羊藿飲片2000 g，加入8倍量的水，提取2次，每次1 h，過濾、常壓濃縮至100 mL，相當(dāng)于生藥濃度為20 g/mL，用蒸餾水倍比稀釋至10 g/mL，5 g/mL；柳氮磺吡啶（SASP）腸溶片購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.25g/片，生產(chǎn)批號09170907，有效期為20190904。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型建立及分組 實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食、不禁水24 h，稱重。隨機(jī)分為空白對照組、模型組、淫羊藿高、中、低劑量組、柳氮磺吡啶（SASP）組及聯(lián)合治療組，每組12只。

除空白對照組外，其余各組均采用TNBS法進(jìn)行造模，具體方法為：動物麻醉后，將橡膠管(直徑2 mm、長15 cm)緩緩插入大鼠肛門8 cm，將抽取好的TNBS液(原液與50%無水乙醇1:1混合)注入，注入體積為0.8 mL，使藥液緩慢進(jìn)入腸道，將大鼠提尾倒置30 s，共造模72只。待清醒后自由飲食，自由進(jìn)水。觀察各組大鼠大便、精神狀態(tài)及皮毛等變化。造模后第7天開始灌胃給藥，連續(xù)7天。分組和給藥方案見表1。

表1 7組大鼠的試驗(yàn)藥物及給藥方案

1.4.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及檢測方法 （1）動物狀態(tài)觀察：定期觀察記錄動物狀態(tài)（大便、精神狀態(tài)及皮毛等）。（2）體重稱量：給藥開始每天給實(shí)驗(yàn)大鼠稱重1次并記錄，如給藥中途動物體重下降超過20%，停止給藥。（3）疾病活動指數(shù)（DAI）評估[5]：自實(shí)驗(yàn)處理后每日觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、運(yùn)動、進(jìn)食情況、毛發(fā)數(shù)量、密度以及光澤情況，記錄大鼠DAI=體質(zhì)量變化+便血程度+大便黏度，評分標(biāo)準(zhǔn)包括體質(zhì)量下降（＜1為0分，1%～5%為1分，5%～10%為2分，10%～15%為3分，≥15%為4分）、大便黏度（正常為0分，松散大便為2分，腹瀉為4分）和大便出血（正常為0分，隱血陽性為2分，顯性出血為4分）。（4）結(jié)腸大體損傷評分：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄結(jié)腸中潰瘍面積、結(jié)腸重量與長度比值、結(jié)腸損傷程度（結(jié)腸外觀正常為0分；結(jié)腸沒有出現(xiàn)紅斑但無潰瘍?yōu)?分；炎癥及潰瘍?yōu)?分；嚴(yán)重的潰瘍但未出現(xiàn)壞疽為3分）。（5）病理損傷評分：將結(jié)腸組織石蠟切片行HE染色，按照Geboes等的標(biāo)準(zhǔn)，于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化并進(jìn)行病理損傷評分，根據(jù)急性炎細(xì)胞、慢性炎細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞在結(jié)腸組織的浸潤程度依次設(shè)為0、1、2、3分；根據(jù)隱窩破壞程度、糜爛程度的不同設(shè)為0、1、2、3分；根據(jù)水腫程度、潰瘍侵及程度設(shè)為0、1、2、3、4分。（6）免疫組化法檢測結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子（TNF）-α、γ干擾素（IFN-γ）及白細(xì)胞介素（IL）-6表達(dá)水平：將組織放入包埋框中央，將石蠟倒入包埋框中，凝固后便可切片；將組織切片放入烘箱中燒烤20 min，將組織置于二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min，無水乙醇5 min，95%乙醇5 min，75%乙醇5 min，去離子水浸泡3次，每次1 min；將切片置于檸檬酸緩沖液中，高壓熱修復(fù)10 min；滴加適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10～15 min；將一抗稀釋后滴在組織切片上，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次每次5 min，將稀釋好的二抗滴在組織切片上，室溫孵育2 h；滴加適量配置好的DAB顯色劑，室溫2～5 min，自來水沖洗；蘇木精復(fù)染10～30 s，自來水沖洗；滴加中性樹膠封固后拍照。使用ImageJ軟件對各組所拍照圖片的灰度值進(jìn)行分析定量測算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用表示，多組比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較，若方差齊性用LSD-t法，方差不齊用Dunnett T3法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠試驗(yàn)期間體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)第4天開始，各實(shí)驗(yàn)組大鼠與模型組比較體質(zhì)量增加，實(shí)驗(yàn)第7天聯(lián)合組大鼠較SASP組體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間平均體質(zhì)量變化

2.2 各組大鼠DAI評分 大鼠精神狀態(tài)改善，大便逐漸成形，進(jìn)食增多，皮毛逐漸有光澤，應(yīng)用淫羊藿及SASP后大鼠精神狀態(tài)改善，DAI評分降低。第5天開始，各實(shí)驗(yàn)組DAI評分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠DAI評分

2.3 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷評分 與模型組比較，聯(lián)合組的結(jié)腸潰瘍面積顯著減小，結(jié)腸重量與長度比減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，淫羊藿高、中、低劑量組及聯(lián)合組的結(jié)腸損傷程度減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合組的結(jié)腸潰瘍面積小于SASP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷評分比較

2.4 各組結(jié)腸組織病理學(xué)評分及腸組織TNF-α、IFN-γ和IL-6表達(dá)情況：淫羊藿組高劑量組評分顯著低于模型組（P＜0.05），見表5。免疫組化檢測顯示聯(lián)合組TNF-α、IFN-γ和IL-6表達(dá)水平與模型組及SASP組比較降低（見圖1）；對各組TNF-α、IFN-γ和IL-6免疫組化表達(dá)情況（灰度值）使用Image J軟件進(jìn)行量化，結(jié)果顯示聯(lián)合組及SASP組與模型組比較顯著降低（P＜0.01），聯(lián)合組較SASP組顯著降低（P＜0.01），見表5。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，大多累及直腸與結(jié)腸黏膜及黏膜下層，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便、體重減輕、結(jié)腸縮短等[6]，治愈難度大，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。UC的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療上盡管目前有很多新型藥物投入使用，但大多治療后僅臨床癥狀緩解，仍需長期服用藥物控制癥狀，尚缺乏特效藥物，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7]。目前廣泛的認(rèn)知認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎屬于自身免疫相關(guān)性疾病，與腸道菌群的失調(diào)、腸道自身免疫系統(tǒng)的失衡，飲食結(jié)構(gòu)的不合理、相關(guān)遺傳敏感性、精神心理等多種因素相關(guān)聯(lián)。

潰瘍性結(jié)腸炎按照其臨床表現(xiàn)，可歸于我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“腸澼”“腸風(fēng)”“泄瀉”等范疇。認(rèn)為該病的發(fā)生歸咎于先天腎氣虧虛，加之后天脾胃虛損，后因外感邪氣，飲食不潔，情志異常導(dǎo)致。認(rèn)為本病的主要病機(jī)為脾腎虧虛，胃腸積滯為標(biāo)，瘀血貫穿本病始末，治療上應(yīng)以建補(bǔ)脾腎為主，輔以祛瘀導(dǎo)滯。淫羊藿作為中國傳統(tǒng)的中草藥，具有溫腎壯陽，強(qiáng)筋骨，御風(fēng)濕等功效，其主要有效成分是淫羊藿多糖（EPS）、淫羊藿苷（ICA）、淫羊藿總黃酮（TFE）?，F(xiàn)代藥理研究已經(jīng)證實(shí)淫羊藿有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[8-12]。淫羊藿苷作為提取物，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于臨床上增強(qiáng)免疫力，抗疲勞，增加精子活力等方面。相關(guān)研究顯示淫羊藿苷可提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，可恢復(fù)受環(huán)磷酰胺損傷的胸腺結(jié)構(gòu)；同時對巨噬細(xì)胞吞噬功能有明顯增強(qiáng)效應(yīng)，并且效應(yīng)呈劑量依賴性關(guān)系，其機(jī)制可能與淫羊藿苷在mRNA水平通過抑制NF-κB與iNOS mRNA、TNF-α mRNA基因增強(qiáng)子的結(jié)合而減少TNF-α和NO量的過度表達(dá)來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13]。

表5 各組病理學(xué)評分及TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)水平比較

圖1 各組結(jié)腸組織中TNF-α、IFN-γ和IL-6的免疫組化表達(dá)（100×）

鑒于淫羊藿的免疫調(diào)節(jié)作用，而潰瘍性結(jié)腸炎作為自身免疫相關(guān)性疾病，本研究以此為切入點(diǎn)研究淫羊藿對潰瘍性結(jié)腸炎是否有免疫調(diào)控作用，嘗試為潰瘍性結(jié)腸炎的臨床及科研提供新的思路。在7天的各組實(shí)驗(yàn)處理監(jiān)測體質(zhì)量及大鼠一般情況監(jiān)測之后，顯示大鼠短期內(nèi)無明顯不良異常反應(yīng)，且各組在體重監(jiān)測上差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。潰瘍性結(jié)腸炎的TNBS可引起結(jié)腸黏膜呈慢性炎癥變化，與人類UC相似，因其造模操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用、造模時間短、重復(fù)性好等特點(diǎn)[7]，本研究選用TNBS誘導(dǎo)UC模型進(jìn)行研究，以評價淫羊藿對UC的療效。TNBS造模后大鼠出現(xiàn)精神沉郁，活動減少，大便稀軟，體重下降等癥狀，再對隨機(jī)選取4例大鼠，將病變結(jié)腸剪取后發(fā)現(xiàn)其結(jié)腸黏膜縮短，病理切片顯示隱窩膿腫形成，符合潰瘍性結(jié)腸炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)處理我們選用淫羊藿高、中、低劑量組，希望更能反映出其量效關(guān)系。作為潰瘍性結(jié)腸炎的臨床一線用藥，SASP對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的治療作用明顯，但本次動物實(shí)驗(yàn)顯示，相比SASP，淫羊藿聯(lián)合SASP治療潰瘍性結(jié)腸炎療效更佳。淫羊藿聯(lián)合SASP治療大鼠UC對緩解結(jié)腸損傷程度、降低DAI評分、改善大鼠精神狀況療效更顯著。在對各實(shí)驗(yàn)組潰瘍性結(jié)腸炎微觀病理學(xué)檢測方面，同時顯示淫羊藿聯(lián)合SASP治療組的微觀病理緩解更為明顯。本實(shí)驗(yàn)同時對各實(shí)驗(yàn)組的相關(guān)炎癥介質(zhì)進(jìn)行的檢測，嘗試推測淫羊藿對潰瘍性結(jié)腸炎作用療效的相關(guān)作用機(jī)制，顯示在TNF-α、IFN-γ和IL-6表達(dá)水平上，聯(lián)合治療組均較其他組有明顯優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)大部分是從臨床癥狀及病理學(xué)上顯示淫羊藿對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠有一定的療效，但其療效的機(jī)制尚不明確。

綜上所述，淫羊藿可減輕TBNS誘導(dǎo)的大鼠UC 結(jié)腸黏膜炎癥損傷、改善大鼠精神狀態(tài)、降低DAI評分、緩解潰瘍性結(jié)腸炎的病理損傷，且與緩解TNF-α、IFN-γ和IL-6細(xì)胞因子異常變化有關(guān)，但其能否作為治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物及其更深層次的作用機(jī)理尚需進(jìn)一步的研究。