Snail基因mRNA與結腸癌患者預后的生物信息學分析

劉 巖， 李雙標， 許 華， 張志堅， 李勝水， 張全樂， 張鳳梅

結直腸癌（colorectal cancer, CRC）是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。相關研究顯示，CRC的發(fā)病率與高動物蛋白飲食相關[2-3]。同時近年來的研究顯示環(huán)境因素在CRC發(fā)病中同樣發(fā)揮重要作用[4]。結直腸癌的發(fā)生是一個涉及多基因、多步驟的病理過程。首先病變起源于正常結直腸上皮，逐漸發(fā)展成為腺瘤等癌前病變，腺瘤可進一步發(fā)展為具有轉移潛能的侵襲性結直腸癌。

CRC的總病死率約為50%，診斷時的手術分期是預測患者預后的最重要因素，Ⅰ期患者的5年生存率超過90%，而Ⅳ期患者的5年生存率則低于10%[5]。隨著分子生物學技術及二代測序技術的不斷發(fā)展，眾多與腫瘤預后有關的基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因在腫瘤組織及正常組織中往往呈現(xiàn)差異表達，并與患者的預后有關。

Snail基因定位于人20號染色體q13.13區(qū)，其編碼蛋白為一種鋅指轉錄抑制因子，其生物學功能與中胚層、外胚層細胞內(nèi)某些基因的下調表達有關。該基因編碼的核蛋白被認為是胚胎形成的關鍵蛋白。近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)Snail在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，然而Snail在結直腸癌中的研究鮮有報道，其具體生物學功能不明。

1 資料與方法

1.1 Snail表達水平分析 檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，對比各組織及實體腫瘤組織中Snail基因的表達水平。檢索條件為“結直腸癌”“結腸癌”“直腸癌” “snail”，物種為人類。同時比較snail基因在結直腸癌患者癌組織和癌旁組織中是否存在表達差異。存在差異表達的條件為snail基因mRNA上調或下調表達超過 2 倍（|Log2FC|>1），且P<0.05[6]。

1.2 Snail蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡 應用STRING數(shù)據(jù)庫構建snail蛋白相互作用的蛋白-蛋白網(wǎng)絡，snail蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡構建條件為置信度大于0.7，相互作用來源為共表達、基因功能和比鄰關系[7]。

1.3 Snail基因共表達及生存分析 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，依據(jù)與snail基因共表達關系，對與snail基因存在相關性的基因進行聚類。同時選取正相關和負相關表達最為明顯的2個基因進行分析，計算spearman相關系數(shù)；根據(jù)snail基因mRNA在結直腸癌患者癌組織中表達的中位數(shù)，分為高、低表達組，繪制生存分析曲線，并進行l(wèi)og-rank檢驗比較高、低表達組患者總生存期（OS）和無疾病進展生存期（DFS）是否存在差異。

1.4 免疫組化檢測Snail蛋白表達 選取河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院收治的結直腸癌患者69例，采用免疫組織化學法檢測腫瘤組織中Snail蛋白表達水平，分析Snail蛋白表達水平與患者臨床病理特征的關系。免疫組織化學法檢測Snail蛋白表達按試劑盒操作說明進行。Snail蛋白表達高低判定標準：在顯微鏡下隨機選取3個高倍視野下進行觀察。染色強度評分：不著色(0分)、淺黃(1分)、棕黃(2分)、棕褐色(3分)；陽性細胞比例評分：陽性<10%(0分)；陽性10%～25%(1分)；陽性26%～50%(2分)；陽性51%～75%(3分)及陽性>75%(4分)?？傮w評分值=陽性細胞比例評分×染色強度評分；最終評判：<6分為低表達，≥6分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學分析 用stata12.0軟件進行分析，計量資料以表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料采用例表示，比較用卡方檢驗，采用log-rank檢驗比較高、低表達組的生存期，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Snail基因表達 Snail蛋白在膀胱、甲狀腺和脂肪組織中表達水平較高，而在胸腺和淋巴細胞中表達水平較低（圖1A）；Snail基因在各種腫瘤組織中的表達差異并不明顯（圖1B）；在結直腸癌患者中，癌組織Snail基因表達水平明顯高于對應的癌旁組織（圖1C）。但Snail表達水平在不同臨床分期結直腸癌患者中差異不顯著(P>0.05，圖1D）。

圖1 Snail基因在結直腸癌和其他腫瘤中的表達

2.2 Snail蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡（PPI） 利用STRING數(shù)據(jù)庫對Snail蛋白相關的基因編碼蛋白進行蛋白相互作用網(wǎng)絡構建。PPI網(wǎng)絡中與Snail蛋白相互作用最為緊密的蛋白10個（圖2）。各個蛋白間相互租用關系的緊密程度采用連線表示，兩兩蛋白間連線越粗表示相互作用關系越緊密。PPI網(wǎng)絡中相互作用關系共55個，區(qū)域聚類指數(shù)為1.0，蛋白相互作用網(wǎng)絡富集顯著（P<0.05）。

2.3 Snail基因共表達分析 TCGA數(shù)據(jù)庫中，與Snail表達呈正相關最顯著的基因為PDGFB基因（r=0.625,P<0.05），與Snail表達呈負相關最顯著的基因為SLC44A4(r=–0.48,P<0.05)，見圖3、4。

2.4 Snail生物學功能富集 Snail及其相關基因生物學過程主要富集于組蛋白H4脫乙?；⑹荏w生物合成過程的正調控、受體生物合成過程的正調控等；細胞成分主要富集于ESC/E（Z）復合體、Sin3絡合物、轉錄抑制復合物等；分子功能主要富集于NAD依賴性組蛋白脫乙酰酶活性（H3-K14特異性）、組蛋白脫乙酰酶活性和啟動子特異性染色質結合等，見表1。

圖2 與Snail蛋白相互作用網(wǎng)絡信號通路網(wǎng)絡（PPI）

圖3 Snail基因共表達分析熱圖

圖4 Snail共表達正負相關基因散點圖

表1 Snail及相關基因GO功能富集

2.5 KEGG信號通路 Snail基因相關信號通路主要富集于腫瘤相關信號通路、Notch信號通路、Wnt信號通路和結直腸癌相關信號通路等（圖5，表2）

2.6 生存分析依據(jù) 預后分析提示SnailmRNA高表達組的OS低于低表達組（HR=1.6,P<0.05圖6A）；而高、低表達組的DFS差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖 6B）。

2.7 Snail蛋白表達 免疫組化顯示Snail蛋白主要表達于癌細胞膜和細胞核，呈棕褐色顆粒，圖7。Snail蛋白高表達結直腸癌患者的OS低于低表達患者，圖8。

圖5 Snail及相關基因KEGG信號通路氣泡圖

表2 Snail及相關基因KEGG信號通路

圖6 Snail基因mRNA表達與結直腸癌患者生存情況之間的關系

圖7 Snail蛋白表達免疫組化分析（×200，×400）

圖8 Snail蛋白高、低表達與結直腸癌患者預后關系

2.8 Snail蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 Snail蛋白在結直腸癌患者癌組織中的高表達率為59.2%（41/69）。Snail蛋白高表達者腫瘤分化程度較低，淋巴結轉移、淋巴管侵犯率較高且Dukes分期較晚，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 Snail蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

1987年Boulay等[8]通過對果蠅研究發(fā)現(xiàn)并首先描述了Snail基因。后來證明了Snail是中胚層形成的必要條件[9]。Snail被分離鑒定出來的20年時間里，Snail家族50多個家庭成員被先后發(fā)現(xiàn)，并具有類似的生物學功能[10]。Snail基因最顯著的生物學功能為誘導上皮間質轉化（EMT）表型改變[11-12]。Snail誘導的EMT將上皮細胞轉化為具有遷移特性的間充質細胞，這些遷移特性有助于胚胎發(fā)育過程中許多組織的形成和上皮腫瘤侵襲特性的獲得。Snail誘發(fā)的EMT部分是由于E-Cadherin轉錄受到直接抑制所引發(fā)的。由于E-Cadherin在腫瘤中的缺失被認為是一種預后不良指標。E-Cadherin表達缺失或被抑制被認為是惡性表型的重要標志，同時也是抗侵襲藥物的潛在研究靶點。然而，有些細胞的運動過程不需要完全的EMT，例如果蠅和無性脊椎動物胚胎（缺乏羊膜的脊椎動物胚胎，如兩棲動物和魚類胚胎）的中胚層形成[13-14]。然而，最近的證據(jù)顯示Snail基因也可以通過調節(jié)細胞粘附和遷移參與上述過程[15]。因此，Snail基因的主要功能可能是調節(jié)細胞黏附而不是誘導EMT。在這種情況下，EMT只是這些轉錄因子用來允許細胞運動的機制之一。

近年來的研究顯示Snail基因在人類多種實體腫瘤中呈現(xiàn)明顯的差異表達，包括非小細胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等[16-18]。Hu等[16]采用免疫組化檢測了89例乳腺癌和50例乳腺良性腫瘤組織中Snail的表達水平，發(fā)現(xiàn)Snail蛋白表達與乳腺癌患者的淋巴轉移及預后不良有關。Wang等[17]在研究Snail蛋白在前列腺癌中的表達時發(fā)現(xiàn)，Snail蛋白在前列腺癌中表達水平明顯上調，高表達患者的OS及DFS明顯降低，提示Snail蛋白是前列腺癌患者預后不良的危險因素。

本研究首先采用生物信息分析方法探討Snail基因在結直腸癌中的表達情況，并分析其高低表達與患者預后的關系。研究證實Snail基因在結直腸癌患者中呈現(xiàn)高表達，并與患者的生存期縮短有關。同時，進一步采用免疫組織化學證實Snail蛋白高達者腫瘤分化程度較低、淋巴結轉移、淋巴管侵犯率較高且Dukes分期較晚，與生物信息分析結果基本一致。

目前，Snail基因被認為可能參與了多種實體腫瘤轉移的生物學過程，其機制主要與誘導EMT有關。隨著更多關于Snail基因調控腫瘤轉移分子機制研究的開展，Snail可能成為原發(fā)性和轉移性結直腸癌的重要治療靶點。