HPLC法測定米力農(nóng)的有關(guān)物質(zhì)

于 峰，張曼紅，田景振，劉建洋

(山東紳聯(lián)藥業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 250000)

米力農(nóng)是非洋地黃、非兒茶酚胺類強(qiáng)心藥，是人工合成的第二代磷酸二酯酶Ⅲ抑制藥，通過抑制磷酸二酯酶Ⅲ的活性增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，改變心肌細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而產(chǎn)生正性肌力作用，同時(shí)還通過提高血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP含量而具有擴(kuò)血管作用，臨床上適用于急性代償性心力衰竭患者的短期靜脈治療[1-4]。本品由荷蘭Sterling-Winthrop公司研究開發(fā)，1990年上市銷售，僅用于靜脈滴注，商品名Corotrop，Primacor[5]。本研究通過高效液相色譜法測定米力農(nóng)的有關(guān)物質(zhì)，此方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于米力農(nóng)的有關(guān)物質(zhì)檢查。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10AT vp高效液相色譜儀(島津SPD-10A vp紫外檢測器)；島津UV2600型紫外可見分光光度計(jì)；QUINTIX125D-1CN電子天平(賽多利斯公司)；FE-28臺式酸度計(jì)(梅特勒-托利多)。

1.2 試藥

米力農(nóng)樣品(自制，批號：200101、200102、200103)；米力農(nóng)對照品(來源：中國藥品生物制品檢定所，批號：101065-201901，含量：按C12H9N3O計(jì)含量為99.0%)；米力農(nóng)雜質(zhì)A對照品(來源：中國藥品生物制品檢定所，批號：101066-201901，含量：99.2%)；乙腈(色譜純，ASTOON，4 L/瓶)；水(市售純凈水，杭州哇哈哈哈集團(tuán))，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

取米力農(nóng)與米力農(nóng)雜質(zhì)A對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中分別約含2 μg的混合溶液，作為對照品溶液。

取中間體I適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含2 μg的溶液，作為中間體Ⅰ溶液。

取中間體Ⅱ適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含2 μg的溶液，作為中間體Ⅱ溶液。

取起始原料4-甲基吡啶適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含2 μg的溶液，作為起始原料溶液。

取米力農(nóng)雜質(zhì)A、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、起始原料4-甲基吡啶和米力農(nóng)各適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中分別約含2 μg的混合溶液，作為混合溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱為Waters C8色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，以磷酸氫二鉀溶液(取磷酸氫二鉀2.7 g，加水800 mL溶解后，加三乙胺2.4 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.5)-乙腈(80∶20)為流動相，流速1.0 mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，可同時(shí)有效檢出起始原料4-甲基吡啶、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、米力農(nóng)和米力農(nóng)雜質(zhì)A，各色譜峰保留時(shí)間分別約為13.1、6.0、19.7、7.3和4.2 min，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，均能實(shí)現(xiàn)基線分離，色譜圖見圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取本品約20 mg，按表2中的破壞方法進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)。取破壞后溶液，放冷后，加流動相稀釋至10 mL，濾過，取續(xù)濾液作為溶液狀態(tài)下各破壞供試品溶液。固體狀態(tài)下按表2中的破壞條件降解后，加流動相配制成相同濃度的溶液，作為固體狀態(tài)下各破壞供試品溶液。取各供試品溶液20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各破壞試驗(yàn)同時(shí)做相應(yīng)的空白試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表3。由試驗(yàn)結(jié)果可知，本品在高溫、光照、酸降解條件下未見明顯雜質(zhì)產(chǎn)生；在堿降解條件下主要降解產(chǎn)物為米力農(nóng)雜質(zhì)A，占5.698%；在氧化狀態(tài)下主要降解產(chǎn)物為米力農(nóng)雜質(zhì)A和氧化產(chǎn)物1，分別占3.497%和3.247%。主峰與雜質(zhì)之間均能實(shí)現(xiàn)基線分離，表明該方法專屬性良好。并根據(jù)降解前后峰面積計(jì)算物料平衡，結(jié)果見表3。

表2 強(qiáng)制降解試驗(yàn)方法

表3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果(面積歸一化法)

2.4 線性試驗(yàn)

分別取米力農(nóng)對照品與米力農(nóng)雜質(zhì)A對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中分別約含20 μg的混合溶液。分別精密量取上述溶液0.5、2.5、5、7.5、10 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的對照品溶液。精密量取上述對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，以溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，同時(shí)計(jì)算定量限(LOQ)和檢測限(LOD)，結(jié)果見表 4。結(jié)果表明米力農(nóng)和米力農(nóng)雜質(zhì)A分別在0.199～3.978 μg·mL-1和0.201～4.024 μg·mL-1范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表4 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度和穩(wěn)定性

由兩位分析人員在不同時(shí)間、不同設(shè)備上，分別平行測定6份供試品溶液，結(jié)果見表5。計(jì)算米力農(nóng)雜質(zhì)A和其他雜質(zhì)之和分別為0.049%和0.017，RSD(n=12)分別為4.57%和2.55%。

表5 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

取本品，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含2 mg的溶液，作為供試品溶液；將供試品溶液室溫放置8 h，并于0、2、4、6、8 h時(shí)，精密量取各溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見表6。米力農(nóng)雜質(zhì)A各時(shí)間點(diǎn)RSD為1.31%，與0時(shí)相比，無顯著性差異。其他雜質(zhì)峰面積之和RSD為0.93%。結(jié)果表明，室溫條件下，供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 回收率試驗(yàn)

精密稱取米力農(nóng)雜質(zhì)A對照品適量，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含2 μg的溶液，作為對照品貯備液。

精密量取本品(米力農(nóng)雜質(zhì)A含量為0.049%)約50 mg共9份，分置于25 mL量瓶中。精密量取上述對照品貯備液5、10和15 mL，各3份，分別加入各個(gè)量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取米力農(nóng)雜質(zhì)A對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含2 μg的溶液，作為對照品溶液。

精密量取上述各供試品溶液及對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見表7。結(jié)果表明采用本法測定米力農(nóng)雜質(zhì)A準(zhǔn)確度良好。

表7 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測定

取三批自研產(chǎn)品(批號：200101、200102、200103)，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，米力農(nóng)雜質(zhì)A按外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行計(jì)算，其它雜質(zhì)按主成分自身對照法計(jì)算，結(jié)果見表8。

表8 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

根據(jù)合成工藝，米力農(nóng)中間體Ⅱ[1-乙氧基-2-(4-吡啶基)-乙烯基甲基酮]在220 nm波長處的吸光度遠(yuǎn)小于在254 nm波長處的吸光度，而米力農(nóng)及米力農(nóng)雜質(zhì)A在254 nm波長處均有較強(qiáng)的吸收。起始原料4-甲基吡啶和中間體Ⅰ[1-(4-吡啶基)-2-丙酮]均在254 nm波長處有較強(qiáng)吸收。綜合考慮，選擇254 nm作為本品有關(guān)物質(zhì)檢測用波長。

3.2 色譜條件

本試驗(yàn)以磷酸氫二鉀溶液(取磷酸氫二鉀2.7g，加水800 mL溶解后，加三乙胺2.4 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.5)-乙腈(80∶20)為流動相，等度洗脫，主峰與各雜質(zhì)色譜峰之間均能實(shí)現(xiàn)基線分離，且各色譜峰純度均能達(dá)100%。

3.3 雜質(zhì)含量計(jì)算方法

本試驗(yàn)將雜質(zhì)A作為已知雜質(zhì)進(jìn)行研究，其校正因子為1.0，為準(zhǔn)確計(jì)算樣品中雜質(zhì)A的含量，確定采用外標(biāo)法按峰面積計(jì)算其含量。