趙 瑩,黎翠英,蘇璐丹,張聲源,3,聶 華,3
(1.嘉應學院醫(yī)學院 客家藥用生物資源研究所,廣東 梅州 514031;2.江門市蓬江區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院,廣東 江門 529030;3. 嘉應學院 廣東省山區(qū)特色農業(yè)資源保護與精準利用重點實驗室,廣東 梅州 514031)
鐵甲草(CassiamimosoidesLinn.)為豆科(Leguminosae)決明屬植物含羞草決明的全草,主要分布于廣東、福建、臺灣、貴州、廣西和云南等地,以全草入藥,味甘、微苦,性涼,歸肝、腎和肺經,具有清熱解毒、清肝明目、祛濕、利水、解酒、化積通淋、散疲消癰等功效,可用于濕熱黃疽、暑熱吐瀉,毒蛇咬傷,便秘水腫和癰腫療瘡等的治療[1]。近年來已有研究表明,鐵甲草具有抑制脂肪酶[2]、抑制肝纖維化[3]、保護損傷肝細胞[4]和抗氧化活性[5]的藥理作用。此外,國內外學者對其化學成分也進行了研究,發(fā)現其含有香草酸、木犀草素、槲皮素、(R)-鷹爪三醇、齊墩果酸、大黃素、胡蘿卜苷和β-谷甾醇等[5-6]。但是,對鐵甲草藥材質量控制方面的研究卻很少,亦無對其成分進行定量分析的研究報道。
本文選取鐵甲草中具有抗肝癌作用的大黃素[7-8],作為定量檢測指標成分,采用高效液相色譜法,建立鐵甲草中大黃素的含量測定方法,為鐵甲草質量標準的制定奠定基礎,有利于鐵甲草的資源培育及潛在經濟價值的實現。
Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀(Waters公司);Waters 2998PDA光電二極管陣列檢測器(Waters公司);Waters XBridge Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm,5 μm); WJX-A1000型高速多功能粉碎機(浙江省永康市紅太陽機電有限公司);JP-100S型超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司);MING-CHE 24UV超純水機(法國Merck Millipore公司)。
大黃素對照品(批號:110756-201512),購于中國藥品生物制品檢定研究院;鐵甲草采于廣東省梅州市蕉嶺縣,經嘉應學院醫(yī)學院生藥學翟明老師鑒定為豆科決明屬植物鐵甲草(Cassiamimosoides)的全草;其他試劑均為分析純。
稱取1.00 mg的大黃素標準品于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,制得0.1 mg/mL的大黃素對照品溶液。
稱取鐵甲草粗粉2.00 g,藥材中加入2 mol/L的鹽酸10 mL,充分浸潤后,60℃水浴2 h進行酸水解,濾渣用超純水水洗至中性,烘箱干燥。藥材干燥處理后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液,使乙醇溶液pH值=8,于50℃下超聲30 min,放置至室溫,補足損失的質量,抽濾得樣品濾液,水浴濃縮成浸膏。
浸膏用甲醇進行超聲溶解,離心處理后,取上清液定容至10 mL,溶液過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液注入液相瓶中,制備成供試品溶液以備進樣。
色譜柱:Waters XBridge? Peptide BEH C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相∶甲醇∶0.1%甲酸=85∶15;檢測波長:254 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL,柱溫:35℃。
分別精密吸取“2.1”項下的大黃素對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得濃度為5,10,20,30,40,50 μg/mL系列濃度的大黃素對照品溶液,于“2.3”項的色譜條件下,以大黃素對照品溶液色譜峰面積Y為縱坐標,大黃素對照品濃度 X(μg/mL)為橫坐標,進行線性擬合,得大黃素標準曲線,求得回歸方程為Y=38315X-16555,R2=0.9994,結果表明,在5~50 μg/mL的濃度范圍內,大黃素對照品溶液的峰面積與濃度的線性關系良好,結果見圖1。
圖1 大黃素標準曲線
取項目“2.1”和“2.2”所制備的對照品溶液和供試品溶液,在“2.3”的色譜條件下進樣,大黃素的保留時間為6.19 min左右,峰型穩(wěn)定,分離度良好,有較好的基線分離,未見雜質峰干擾,具有良好的專屬性。
表1 精密度試驗結果
精密吸取對照品溶液1.0 mL,于“2.3”的色譜條件下,連續(xù)重復進樣6次,每次10 μL,檢測得到大黃素峰面積的RSD為0.81% ,表明儀器精密度良好,結果見表1。
精密吸取供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,12 h于“2.3”色譜條件下,檢測大黃素的峰面積,得RSD為1.65% ,表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定,結果見表2。
表2 穩(wěn)定性試驗結果
稱取6份等質量的鐵甲草粗粉2.00 g,按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,于“2.3”項色譜條件下,檢測得大黃素峰面積的RSD為1.42%,表明該方法重復性良好,結果見表3。
表3 重復性試驗結果
精密稱取已知含量的等質量鐵甲草粗粉6份,每份2.00 g,分別精密加入同一濃度的大黃素黃素對照品,按上述“2.2”的提取方法平行制備成供試品溶液,于“2.3”項色譜條件下測定,計算得到平均回收率結果為98.94%,RSD為1.98%。表明該方法測得的結果有良好準確性,結果見表4。
表4 加樣回收率試驗結果(n=6)
表5 鐵甲草中大黃素含量測定結果(n=3)
精密稱取3份不同批樣品,按照“2.2”項的制備方法制備成供試品溶液,每份樣品分別在“2.3”項的色譜條件下進樣三次,記錄峰面積,計算樣品中大黃素的含量,結果見表5。
采用已有報道的鐵甲草的提取方法[9]進行提取,發(fā)現經HPLC檢測時,結果不理想,考慮到大黃素為弱酸性成分,以游離形態(tài)或結合形態(tài)存在,易與鈉、鉀、鈣、鎂等金屬離子結合成鹽存于植物體內,因此,本實驗將鐵甲草提取方法進行改進,在溶劑提取前進行酸水解處理,利于大黃素以游離形式存在;考慮到硫酸的氧化性容易使藥材在水解過程中產生碳化反應,造成藥材的損失,故選擇鹽酸作為水解介質。并且,在考察大黃素的色譜條件時發(fā)現,在流動相中加入適量酸能夠抑制成分解離,使峰型更穩(wěn)定、分離度更好且出峰時間適宜。
大黃素具有保肝護肝作用,有助于改善肝損傷,與鐵甲草的功效相吻合,同時,大黃素也是中藥材常用的檢測指標成分。本研究建立的鐵甲草中大黃素的含量檢測方法,精密度高,穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率均良好,操作簡便,測得鐵甲草含量在0.026%~0.032%,重現性較好,可為鐵甲草含量測定和質量評估提供參考依據。