牛奶中抗生素殘留檢測(cè)的研究現(xiàn)狀

馬 婭，馬麗娜，史俊杰，焦林宏，王紅玉

(蘭州石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730060)

牛奶因其營(yíng)養(yǎng)成分齊全、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易消化吸收等特點(diǎn)，被譽(yù)為“食品之王”，逐漸成為人們生活中不可或缺的一種食品。然而，奶牛飼養(yǎng)中為預(yù)防疾病常在飼料中添加抗生素，服用大劑量抗生素藥物，獲得的奶品中添加抗生素防止其腐壞[1]，這些因素均會(huì)導(dǎo)致抗生素在牛奶中殘留，長(zhǎng)期飲用含抗生素殘留的牛奶不僅危害人類的健康, 同時(shí)由于抗生素對(duì)發(fā)酵乳中發(fā)酵菌種的繁殖產(chǎn)生抑制作用使其發(fā)酵異常從而影響奶制品的品質(zhì)[2]。

世界衛(wèi)生組織(WHO)在1979年就已經(jīng)將抗生素列為污染物，之后各個(gè)國(guó)家都開始關(guān)注牛奶中抗生素殘留檢測(cè)，提出了不應(yīng)檢出抗生素的要求。 2001年中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也規(guī)定了無公害食品-生鮮牛乳中不能檢出抗生素。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2001年10月發(fā)布實(shí)施了《無公害食品生鮮牛乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，明確規(guī)定“新鮮牛乳中抗生素不得檢出”。2002年發(fā)布的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，奶中最高允許殘留量(單位ng/L)標(biāo)準(zhǔn)是：新霉素為500；慶大霉素為200；林可霉素為150；四環(huán)素、土霉素、磺胺類等均為100[3]。但目前為止我國(guó)乳制品中抗生素殘留量超標(biāo)的現(xiàn)象仍然普遍存在。2002年，馬群飛等[4]對(duì)福建省幾個(gè)城市的生牛乳中抗生素殘留情況作了調(diào)查，調(diào)研發(fā)現(xiàn)尤溪市、晉江市、福州市和龍巖市所采集的生牛奶樣品中，抗生素陽(yáng)性率分別為50%、25%、19.5%和9.7%。在2006年[5]，在我國(guó)的一些大城市(西寧、南寧、北京等)進(jìn)行了奶制品質(zhì)量調(diào)研，結(jié)果顯示不合格項(xiàng)目中，抗生素殘留位居第一。目前乳制品中抗生素殘留的問題不可小覷，為保障使用乳品的安全和衛(wèi)生，相關(guān)部門須加強(qiáng)管理且嚴(yán)格檢測(cè)。牛乳中抗生素殘留的常用的檢測(cè)方法有：微生物檢測(cè)法、理化檢測(cè)法和免疫法。

1 微生物檢測(cè)法[6]

微生物檢測(cè)法也叫微生物抑制試驗(yàn)(Migration Inhibition Test)可以定性或定量的測(cè)定牛乳中抗生素殘留量，基于某些抗生素能夠?qū)ξ⑸锏纳頇C(jī)能及繁殖代謝的抑制作用。微生物檢測(cè)法的基本原理，若存在抗生素會(huì)抑制牛奶中培養(yǎng)過微生物的繁殖生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不會(huì)出現(xiàn)渾濁，指示劑的顏色也不會(huì)發(fā)生變化。微生物檢測(cè)因其檢測(cè)價(jià)格低廉、檢測(cè)過程簡(jiǎn)捷、檢測(cè)結(jié)果可靠等特點(diǎn)，是牛乳中抗生素殘留檢測(cè)的一種廣泛且經(jīng)典的方法。常用的微生物檢測(cè)法有：紙片法(PD法)、TTC 法、牛乳活性檢測(cè)法等。

1.1 紙片法

常用的紙片法：枯草桿菌法、嗜熱脂肪芽孢桿菌法。兩種方法的檢測(cè)過程基本一樣，均選用不同的菌種檢測(cè)牛乳中的青霉素(或β內(nèi)酰胺類抗生素)。在培養(yǎng)基上接種菌種(枯草桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌)，放入吸滿被檢乳品的圓形濾紙片，然后放入一張對(duì)照?qǐng)A紙片，該紙片是含有標(biāo)準(zhǔn)抗生素的陽(yáng)性紙片。若牛乳中無抗生素，微生物的繁殖生長(zhǎng)，濾紙圓片不形成無抑菌圈，為陰性。反之，牛乳中存在抗生素或者抑菌物質(zhì)，紙片上形成抑菌圈，為陽(yáng)性。為了確定測(cè)定結(jié)果非假陽(yáng)性及陽(yáng)性物質(zhì)是青霉素(或β內(nèi)酰胺類抗生素)，加熱乳品并加入青霉素酶測(cè)定，沒有抑菌圈說明奶品中存在青霉素(或β內(nèi)酰胺類抗生素)。如果仍出現(xiàn)抑菌圈，說明其他化合物導(dǎo)致了抑菌作用。但是當(dāng)抑菌圈變小且沒完全消失，說明不止一種抑菌化合物存在于奶樣中。該檢測(cè)方法的檢測(cè)限為 0. 01 IU /mL。

1.2 嗜熱鏈球菌抑制法(TTC法)

我國(guó)于2008年頒布并實(shí)施了《鮮乳中抗生素殘留檢測(cè)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB4789.27-2008)，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定鮮乳中抗生素殘留的檢驗(yàn)方法：嗜熱鏈球菌抑制法(TTC)和嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法。這兩種方法檢測(cè)過程基本一致，均可測(cè)定牛奶中抗生素的殘留量。

TTC檢測(cè)過程如下：乳品經(jīng)80℃的殺菌后，添加菌種(嗜熱鏈球菌)，培養(yǎng)一段時(shí)間菌種生長(zhǎng)繁殖，加入TTC，該樣品中不含抗生素或抗生素含量低于檢測(cè)值，菌種繼續(xù)增殖，指示劑TTC被還原成紅色。相反，如果樣品中抗生素含量高于檢出值，抗生素抑制菌種繁殖，TTC不被還原，保持無色。該方法測(cè)定幾種抗生素的最低檢出量如表1所示。

表1 TTC檢測(cè)方法測(cè)定幾種抗生素的最低檢出量

1.3 牛乳活性檢測(cè)法

向乳品中加入適量發(fā)酵劑，發(fā)酵后乳品的pH值降低，牛乳中若有抗生素殘留，則發(fā)酵劑的繁殖被抑制，pH值的變化不大。牛乳活性檢測(cè)法過程：取適量的牛奶進(jìn)行一段時(shí)間的加熱滅菌，然后迅速冷卻降至42℃后，加入發(fā)酵劑，經(jīng)攪拌后測(cè)pH值，一般在6.4左右。再將樣品于42℃保溫培養(yǎng)一段時(shí)間，每30 min 檢測(cè)1次pH值，測(cè)定三次。檢測(cè)過程中，90 min內(nèi)乳品的pH值下降至5.7，屬正常的發(fā)酵活性實(shí)驗(yàn)，代表乳品呈陰性，無抗生素殘留。如果3次檢測(cè)結(jié)果的pH值不變均在 5.7以上，表明存在抗生素，為陽(yáng)性。據(jù)研究乳品中抗生素殘留量達(dá)到 0.015～0.05 U/mL之間時(shí)，會(huì)抑制菌類的發(fā)酵速度，因而需借助做小樣的辦法確定是否抗生素殘留。

2 理化檢測(cè)法

理化檢測(cè)法特點(diǎn)是：高分離效率、高靈敏度、穩(wěn)定可靠的測(cè)定結(jié)果等，是牛奶中抗生素殘留量確定的一種精確檢驗(yàn)方法。該方法對(duì)樣品進(jìn)行一定處理之后要借助實(shí)驗(yàn)室的精密儀器測(cè)定抗生素的含量。雖然這種方法具有很高的精確度，但是該檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)樣品的前處理比較復(fù)雜。常用的理化檢測(cè)方法：高效液相色譜法(HPLC)和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色基于氣相色譜理論通過高壓泵、高效固定相及高靈敏檢測(cè)器等設(shè)備，快速、高效、自動(dòng)化檢測(cè)牛乳中抗生素殘留量，是廣泛使用的一種理化檢測(cè)方法。高效液相色譜法測(cè)定步驟比較復(fù)雜，包括樣品處理、殘留抗生素分離和檢測(cè)。

樣品處理步驟：樣品提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等。樣品提取常用的提取試劑是水和酸化有機(jī)溶劑，脫除樣品中的蛋白和萃取殘留。加拿大HAL用鎢酸鈉、硫酸和水提取組織中青霉素同時(shí)并脫掉蛋白質(zhì)，對(duì)牛乳中的青霉素脫除效果非常好。樣品提取后可采用一些有機(jī)溶劑、無機(jī)酸及超濾法進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀。為減少非極性物質(zhì)的污染，Bioson等用硫酸和鎢酸鈉把青霉素萃入水相，得到較為干凈的水提取液。一般來說，萃取得到的水或有機(jī)提取液中待測(cè)物濃度低，而且含有一些共萃取物導(dǎo)致無法準(zhǔn)確測(cè)定痕量目標(biāo)物，因?yàn)楣草腿∥飼?huì)損害儀器，增加檢測(cè)噪音。為避免出現(xiàn)以上問題，需要對(duì)待測(cè)物進(jìn)行凈化與濃縮。常用的凈化和濃縮方法：免疫親和色譜法、離子交換法和固相萃取法。

殘留組分的分離方式主要包括正相、反相和離子交換三種方式。反相高效液相色譜法具有短時(shí)、高效且可在水系統(tǒng)中完成的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。殘留抗生素被分離后，使用紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器檢測(cè)。紫外檢測(cè)器價(jià)格低、選擇性好的特點(diǎn)，能滿足抗生素殘留的檢測(cè)要求。但是如瓶中抗生素含量低，背景干擾比較嚴(yán)重，常采用柱前或柱后的衍生反應(yīng)來提高其靈敏度。彭莉采用HPLC法測(cè)定了牛奶中氯霉素的殘留量，通過簡(jiǎn)單的樣品前處理，達(dá)到了較高的回收率(平均回收率94.8%)，而且檢測(cè)結(jié)果精密度高，可作為牛奶中氯霉素殘留檢測(cè)的方法。

2.2 色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法

色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法是牛乳中抗生素殘留分析檢測(cè)的趨勢(shì)，常用的色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法：薄層色譜/質(zhì)譜法(TLC/MS)、氣相色譜/質(zhì)譜法(GC/MS)、液相色譜/質(zhì)譜法(LC/MS)、液相色譜/核磁共振法(LC/NMR)、超臨界流體/質(zhì)譜法(SFC/MS)等。液相 /質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用法用液相色譜實(shí)現(xiàn)樣品的有效分離，提供保留時(shí)間，用質(zhì)譜儀分析液相色譜儀的不同洗脫成分，完成定性和定量分析。色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法具有高效、可靠、高通量等特點(diǎn)，可以同時(shí)完成分離、定性及定量檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于確證性分析。然而由于色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法所用儀器價(jià)格貴，檢測(cè)費(fèi)用高，遠(yuǎn)不如HPLC法普及。

3 免疫法[8]

免疫法因其具有檢測(cè)所需樣品量少、檢測(cè)速度快、分析費(fèi)用少、靈敏度高等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和篩選樣品。免疫分析法是抗原、半抗原及抗體發(fā)生特異性的結(jié)合，即抗原/抗體免疫反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的生化檢測(cè)方法。目前免疫檢測(cè)法分為兩大類：(1)相對(duì)獨(dú)立的免疫檢測(cè)法，如放射免疫標(biāo)記技術(shù)(RIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等；(2)聯(lián)用法，將免疫技術(shù)和其他理化檢測(cè)技術(shù)(如氣相色譜、液相色譜)相結(jié)合測(cè)定抗生素殘留，典型測(cè)定方法：免疫親合色譜(IAC)。免疫法具有高選擇性、高靈敏度可以用來凈化氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)的樣品，色譜技術(shù)檢測(cè)效快速、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，將兩種方法相結(jié)合能達(dá)到分析過程簡(jiǎn)捷、分析成本低廉，待測(cè)物范圍廣的目的。目前，磺胺類、鏈霉素類、內(nèi)酰胺類、喹諾酮類以及四環(huán)素類等抗生素已經(jīng)建立了免疫測(cè)定法。

最常用的免疫技術(shù)是ELISA法，固相載體表面吸附已知的抗原或抗體與酶標(biāo)記的抗原或抗體反應(yīng)，通過酶與催化底物顯色測(cè)定待測(cè)物含量。常用的標(biāo)記酶：即辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。ELISA法具有高靈敏度、強(qiáng)特異性、低檢測(cè)費(fèi)用、快檢測(cè)速度、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和奶制品生產(chǎn)企業(yè)中抗生素的快速篩查檢測(cè)方法。ELISA法能完成40個(gè)以上樣品同一種或一類抗生素的測(cè)定，此法對(duì)結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)存在交叉反應(yīng)，無法準(zhǔn)確測(cè)定小分子及穩(wěn)定性差的物質(zhì)。因此，為防止假陽(yáng)性結(jié)果，ELISA法篩查后的陽(yáng)性樣品，還需采用其他理化檢測(cè)方法確證。

4 我國(guó)在牛奶中抗生素使用的檢測(cè)方法及現(xiàn)狀

目前我國(guó)在生產(chǎn)管理上常用的抗生素殘留篩查檢測(cè)方法主要有TTC法和SNAP法(又稱雙流向酶聯(lián)免疫技術(shù))。國(guó)標(biāo)TTC法可同時(shí)測(cè)定幾種能抑制菌種生長(zhǎng)抗生素含量在國(guó)內(nèi)雖應(yīng)用廣泛但因其檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、不易標(biāo)準(zhǔn)化而受到局限。SNAP法獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)可，利用酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體的免疫反應(yīng)，在幾分鐘能快速檢出牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素，敏感性高、特異性好，但是SNAP法需要購(gòu)買專門的試劑和試劑和儀器，導(dǎo)致其檢測(cè)成本增加。針對(duì)該問題，目前國(guó)內(nèi)專家和學(xué)者都在積極研制基于TTC法快速檢測(cè)試紙檢測(cè)技術(shù)。

快速檢測(cè)試紙法操作過程簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、攜帶方便是乳制品中抗生素殘留篩查的發(fā)展趨勢(shì)?？焖贆z測(cè)試紙使用時(shí)，將牛乳滴加或者浸入試紙，在幾分鐘內(nèi)檢測(cè)出牛乳中是否含有殘留抗生素。這種檢測(cè)方法一般用于其他測(cè)試之前，作為快速篩查測(cè)試，當(dāng)顯示結(jié)果為陽(yáng)性需要采取其他新的測(cè)試。2019年[10]劉廣源等以TTC法為基礎(chǔ)，研制了一種能快速檢測(cè)牛乳中氯霉素殘留的試紙，對(duì)牛奶中氯霉素的殘留進(jìn)行快速，有效的檢測(cè)。目前，該方法還處于實(shí)驗(yàn)室的研究階段，它的進(jìn)一步開發(fā)及商業(yè)應(yīng)用還需要很長(zhǎng)一段時(shí)間。