芋頭水溶性多糖的分離純化及其對(duì)巨噬細(xì)胞免疫活性功能的影響

康 慶,林 瑩,蘇穎杰,藍(lán)偉杰,黃 婷,馬二蘭

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

芋頭(ColocasiaesculentaL. Schott,Taro)是芋頭屬天南星科多年生草本植物,古名蹲鴟,又稱(chēng)芋艿、毛芋[1]。芋頭是良好的碳水化合物來(lái)源,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,膳食纖維含量高[2-4],不僅可以食用還可以藥用,自古就以其療效而聞名,具有寬腸胃、補(bǔ)脾胃、腹中癖塊、消癆散結(jié)等作用[5]。有研究認(rèn)為,芋頭的生物功效與其含有的花青素、血凝素、水溶性多糖、蛋白質(zhì)、凝集素等活性成分有關(guān)[6]。多糖是由10個(gè)以上單糖單位通過(guò)糖苷鍵連接的天然高分子化合物,廣泛存在于自然界,具有多種生物活性,研究較多的包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖以及對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[7]。

提取水溶性的多糖一般以水提醇沉為主,有時(shí)為了提高多糖得率會(huì)輔以物理、化學(xué)或生物方法,如超聲、微波和酶法輔助。這些輔助手段或多或少地改變多糖的理化性質(zhì)和功能性質(zhì)[8],為盡可能避免芋頭水溶性多糖的天然性質(zhì)發(fā)生改變,本文選用傳統(tǒng)的提取方法——水提醇沉。目前已有研究證明,芋頭水溶性多糖具有抗氧化、降脂和免疫調(diào)節(jié)的功效[9-11],但對(duì)芋頭水溶性多糖系統(tǒng)地分析,研究芋頭水溶性多糖各組分的免疫活性高低以及在發(fā)揮生物學(xué)活性時(shí)作用方式的差別還不足。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熱水浸提的方式得到芋頭水溶性多糖,利用DEAE-52離子纖維素柱層析和sephadexG-200凝膠柱層析對(duì)芋頭水溶性粗多糖進(jìn)行分離純化,并對(duì)其組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析,研究其對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用,通過(guò)比較不同組分芋頭水溶性多糖在結(jié)構(gòu)以及免疫活性的差異,初步判定不同的芋頭水溶性多糖在免疫活性調(diào)節(jié)中的活性高低和主要作用方式,為提高芋頭資源的食用及商業(yè)價(jià)值及其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芋頭 南寧百貨超市;半乳糖醛酸標(biāo)品 上海麥克林生化科技有限公司;以上試劑均為分析純級(jí);脂多糖(LPS,來(lái)自大腸桿菌055:B5)、0.1%中性紅染色液、NO含量檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;RAW264.7 中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù);高糖DMEM(含丙酮酸鈉)培養(yǎng)基 比利時(shí)BI公司;胎牛血清(FBS) 浙江天杭生物科技股份有限公司;CCK-8試劑盒 新賽美生物科技有限公司;TNF-α及IL-1βELISA試劑盒 南京翼飛雪生物科技有限公司。

InfiniteM200pro酶標(biāo)儀 奧地利TECAN公司;層析柱(1.6 cm×70 cm) 上海滬西分析儀器廠(chǎng)有限公司;TENSOR Ⅱ傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)BRUKER公司;二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 德國(guó)BINDER公司;CKX41SF倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.2 芋頭水溶性多糖的提取和成分測(cè)定

1.2.1 芋頭水溶性粗多糖的提取 參照姜紹通等[12]的方法略有改動(dòng)。以芋頭凍干粉為原料，按30∶1 (mL∶g)料液比沸水浴2 h后取上清液,45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮之后利用Sevage法除蛋白(重復(fù)兩次),后80%乙醇濃度沉降得芋頭粗多糖,凍干得粉末狀粗多糖。其得率按下式計(jì)算：

芋頭水溶性多糖得率(%)=芋頭水溶性多糖凍干粉質(zhì)量(mg)/芋頭凍干粉質(zhì)量(mg)×100

1.2.2 芋頭水溶性粗多糖的成分測(cè)定

1.2.2.1 水分的測(cè)定 根據(jù)GB 5009.3-2016測(cè)定芋頭水溶性粗多糖中的水分含量。

1.2.2.2 多糖含量的測(cè)定 參考姜瓊等[13]優(yōu)化后的苯酚-硫酸法略有改動(dòng)。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):取潔凈具塞試管7支,并編號(hào)1～7。依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL),再加入蒸餾水至2 mL。于每支試管中加入1 mL 5%苯酚溶液并搖勻,然后加入5 mL濃硫酸,沸水浴5 min,冷卻至室溫后在490 nm下測(cè)吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取芋頭粗多糖粉末10 mg,溶于10 mL蒸餾水,過(guò)0.45 μm濾膜后取1 mL加入具塞試管,補(bǔ)充蒸餾水至2 mL,再加入1 mL 5%苯酚溶液,搖勻后加入5 mL濃硫酸,沸水浴5 min后冷卻至室溫測(cè)定490 nm處吸光度值。以蒸餾水做空白對(duì)照。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法,測(cè)定芋頭粗多糖中蛋白質(zhì)含量。繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):取潔凈試管7支,并編號(hào)1～7。依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液后加蒸餾水補(bǔ)充至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液,顯色5 min后在595 nm處測(cè)其吸光度。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取芋頭粗多糖粉末10 mg,溶于10 mL蒸餾水,過(guò)0.45 μm濾膜后取1 mL加入試管中,然后加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液,靜置顯色5 min于595 nm處測(cè)吸光度值。以蒸餾水做空白對(duì)照。

1.2.2.4 糖醛酸含量的測(cè)定 采用間羥基聯(lián)苯法[14],測(cè)定芋頭粗多糖中糖醛酸含量。繪制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):取潔凈具塞試管6支,并編號(hào)1～6。依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(80 μg/mL),補(bǔ)充蒸餾水至0.5 mL。冰浴條件下,于每管中加入5 mL硼砂-濃硫酸溶液(4.77 mg/mL),搖勻后于沸水浴中加熱5 min。加熱結(jié)束后繼續(xù)冰浴至室溫,加入0.1 mL間羥基聯(lián)苯氫氧化鈉溶液(0.15 g間羥基聯(lián)苯溶于100 mL 0.5%氫氧化鈉溶液)顯色后,520 nm處測(cè)吸光值。以半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取芋頭粗多糖粉末10 mg,溶于10 mL蒸餾水,過(guò)0.45 μm濾膜后取0.5 mL加入試管中,冰浴條件下加入5 mL硼砂-濃硫酸溶液,搖勻后沸水浴5 min。冰浴下冷卻至室溫加入間羥基聯(lián)苯氫氧化鈉溶液顯色,于520 nm處測(cè)得吸光度值。以蒸餾水做空白對(duì)照。

1.3 芋頭水溶性多糖的分離純化與鑒定

1.3.1 芋頭水溶性粗多糖的DEAE-52陰離子交換柱層析 準(zhǔn)確稱(chēng)取200 mg芋頭水溶性粗多糖,溶于10 mL超純水中,經(jīng)0.45 μm濾膜和超聲脫氣處理后取10 mL樣品溶液上柱(1.6 cm×70 cm)。經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定洗脫條件為:洗脫速度為0.6 mL/min,每5 min收集1管。依次以超純水和0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫,期間用苯酚-硫酸法測(cè)定各管總糖含量,以管數(shù)為橫坐標(biāo),490 nm處測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)作圖。根據(jù)洗脫峰的強(qiáng)度,收集主要組分。然后45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)濃縮,將濃縮液置于截留分子量為3.5 kDa的透析袋中透析36 h,期間定時(shí)更換蒸餾水,最后經(jīng)冷凍干燥后得芋頭多糖組分粉末。

1.3.2 Sephadex G-200凝膠柱層析 分別稱(chēng)取50 mg在1.3.1中的主要多糖組分,溶于0.02 mol/L NaCl溶液。經(jīng)0.45 μm濾膜和超聲脫氣處理后取5 mL樣品溶液上柱(1.6 cm×70 cm)。洗脫條件:洗脫液選用0.02 mol/L NaCl溶液,流速為0.2 mL/min,每30 min收集1管。用苯酚-硫酸法測(cè)定各管總糖含量,以管數(shù)為橫坐標(biāo),490 nm處測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 將1.3.1得到的芋頭水溶性多糖組分配制成1 mg/mL的溶液,采用SDS-PAGE不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳。電泳條件:濃縮膠中電流40 mA、電壓80 V;分離膠中電流80 mA、電壓120 V。電泳完成后,凝膠采用考馬斯亮藍(lán)法染色,染色后于快速脫色液中脫色20 min,轉(zhuǎn)入常規(guī)脫色液中脫色,最后利用Scion Image軟件拍照分析。

1.3.4 傅里葉紅外光譜測(cè)定 利用常規(guī)方法,準(zhǔn)確稱(chēng)取1.3.1得到的芋頭水溶性多糖組分各5 mg,分別與500 mg溴化鉀混合均勻,并研磨成細(xì)小顆粒,做壓片處理后在紅外4000～400 cm-1波段內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.4 芋頭水溶性多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

1.4.1 芋頭水溶性多糖對(duì)RAW264.7增殖作用的影響 將RAW264.7調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL,接種到96孔板中,37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)4 h后,用100 μL不同濃度(25、50、100、200、400 μg/mL)芋頭水溶性多糖組分處理RAW264.7,同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。目前,在免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中多以脂多糖(LPS)[15]作陽(yáng)性對(duì)照,本實(shí)驗(yàn)以相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液為空白對(duì)照。另,由于1 μg/mL脂多糖不僅對(duì)巨噬細(xì)胞活性無(wú)影響[16],且對(duì)細(xì)胞因子和NO的分泌綜合效果較好[17],決定以1 μg/mL LPS為陽(yáng)性對(duì)照。參考Chen等[18]的方法,稍作改進(jìn)。培養(yǎng)2 h后向每孔加入10 μL CCK-8試劑,培養(yǎng)箱中繼續(xù)反應(yīng)2 h后利用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。用細(xì)胞存活率衡量增殖作用,計(jì)算公式如下:

式中,AS為處理組和陽(yáng)性對(duì)照組吸光度值;AO為空白對(duì)照組吸光度值。

1.4.2 芋頭水溶性多糖對(duì)RAW264.7吞噬作用的影響 利用RAW264.7吞噬中性紅的能力衡量其吞噬能力。按1.4.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)和分組。參考Tang等[19]的方法,加入不同濃度(25、50、100、200、400 μg/mL)芋頭水溶性多糖組分繼續(xù)培養(yǎng)12 h后用100 μL 0.1%中性紅試劑替換,作用4 h后完全去除,加入細(xì)胞裂解液(乙醇∶冰乙酸(v/v)=1∶1)在室溫下作用30 min后利用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處的吸光度值。吞噬活性用吞噬指數(shù)(PI)表示,計(jì)算公式如下:

式中,AS為添加芋頭水溶性多糖和脂多糖組的吸光度值;AO為空白對(duì)照組吸光度值。

1.4.3 芋頭水溶性多糖對(duì)RAW264.7的NO分泌量的影響 按1.4.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)和分組后繼續(xù)培養(yǎng)12 h,取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,1000 r/min離心5 min去掉不溶物后按試劑盒操作說(shuō)明,加入等體積的Griess試劑Ⅰ和Griess試劑Ⅱ,室溫靜置反應(yīng)15 min,于96孔板測(cè)定550 nm處的吸光度值。

1.4.4 芋頭水溶性多糖對(duì)RAW264.7的TNF-α和IL-1β分泌量的影響 按1.4.3的方法獲得各組細(xì)胞上清液后,按TNF-α及IL-1βELISA試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)平行,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析,Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芋頭水溶性粗多糖的組分測(cè)定

按1.2.1的方法得到芋頭水溶性粗多糖,得率為3.19%。Li等[6]在熱水浸提的基礎(chǔ)上,輔以微波處理后得到芋頭粗多糖的得率為4.12%,雖提高了多糖得率,但Li所獲得的芋頭多糖分子量均在10 kDa左右,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Park等[11]通過(guò)水提法得到的分子量為200 kDa的芋頭多糖,這可能是由于微波處理使多糖分子降解。為盡可能保持芋頭水溶性多糖本來(lái)的結(jié)構(gòu),保留其天然性質(zhì),本文選擇以相對(duì)溫和常規(guī)水提法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照1.2.2方法得到葡萄糖、牛血清蛋白和半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程分別為:y=15.03x-0.1098,R2=0.997;y=0.0041x+0.0188,R2=0.9934;y=8.6x-0.003,R2=0.9937。據(jù)此測(cè)得的芋頭水溶性粗多糖組分含量如表1所示。芋頭粗多糖中主要成分為多糖,含量達(dá)到61%,糖醛酸含量約為13%,說(shuō)明其中含有酸性多糖。樣品中依然含有少量蛋白質(zhì),這部分蛋白可能是與多糖結(jié)合形成了聚合物,也可能是蛋白雜質(zhì)。另因南寧回南天,空氣濕度高,高達(dá)90%以上,導(dǎo)致樣品易吸潮,故樣品水分含量較高,占16%。

表1 芋頭水溶性粗多糖化學(xué)組成

2.2 芋頭水溶性多糖的純化和鑒定

2.2.1 芋頭水溶性粗多糖的DEAE-52陰離子交換柱層析 前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DEAE-52纖維素對(duì)多糖具有顯著吸附作用,在1 h內(nèi)可有效吸附多糖,故選用DEAE-52進(jìn)行陰離子交換柱層析,得到洗脫曲線(xiàn)如圖1所示。芋頭水溶性粗多糖經(jīng)超純水和不同濃度的NaCl溶液梯度洗脫后得到四個(gè)洗脫峰,如圖1所示。相比Li等[6]的分離結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)多得到一個(gè)0.3 mol/L NaCl洗脫組分。其中超純水洗脫組分有最強(qiáng)的吸收峰,說(shuō)明芋頭水溶性多糖中主要為中性多糖,命名為T(mén)PS1。其次為0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到的酸性多糖組分,命名為T(mén)PS2。收集兩種主要組分,濃縮并透析脫鹽后進(jìn)行冷凍干燥,得到兩種白色多糖粉末,得率分別為53.28%和39.84%,純度分別為87.4%和81.5%,高于姜紹通等[12]相同洗脫組分的82%和68%。符合預(yù)期實(shí)驗(yàn)設(shè)想,可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

圖1 芋頭水溶性多糖的洗脫曲線(xiàn)

2.2.2 芋頭水溶性多糖主要洗脫組分的Sephadex G-200凝膠柱層析 凝膠具有一定大小的孔徑,起到分子篩的作用。大分子優(yōu)先流出,而小分子滯后流出,從而將不同分子量大小的多糖分離開(kāi)。經(jīng)DEAE52-纖維素純化后得到的兩種主要多糖組分TPS1和TPS2,進(jìn)一步經(jīng)過(guò)SephadexG-200凝膠柱,均得到單一洗脫峰,如圖2所示。故初步認(rèn)為T(mén)PS1和TPS2為單一組分[20-21]。

圖2 TPS1和TPS2的Sephadex G-200 凝膠柱洗脫曲線(xiàn)

2.2.3 芋頭水溶性多糖組分的鑒定

2.2.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 圖3電泳圖顯示,通過(guò)DEAE52-纖維素離子交換樹(shù)脂后得到的TPS1和TPS2中的蛋白含量明顯減少,小分子量的蛋白基本去除。48 kDa左右的蛋白在TPS1和TPS2中依然存在。另外,與超純水洗脫出來(lái)的TPS1相比較,0.1 mol/L NaCl溶液洗脫出的TPS2中依然含有63～75 kDa的蛋白。另,SephadexG-200凝膠柱層析結(jié)果顯示TPS1和TPS2為單一多糖,故認(rèn)為T(mén)PS1和TPS2可能是含有少量蛋白的多糖蛋白復(fù)合物。

圖3 芋頭水溶性多糖組分的電泳圖

2.2.3.2 紅外光譜分析 TPS1和TPS2的紅外光譜分析圖如圖4所示,二者均在3404 cm-1附近處出現(xiàn)寬而強(qiáng)的吸收峰,此為O-H伸縮振動(dòng)峰,在2928.53和2934.17 cm-1處出現(xiàn)相對(duì)較弱的特征吸收峰,為C-H伸縮振動(dòng)峰。以上區(qū)域出現(xiàn)的吸收峰是糖類(lèi)化合物的特征吸收峰[22-23]。1600 cm-1附近分別出現(xiàn)一弱一強(qiáng)的吸收峰(TPS1:1639.18 cm-1;TPS2:1642.95 cm-1),由羧基的C=O的非對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)引起,初步表明TPS2含有大量的糖醛酸。TPS2在1542.55 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰,為H-N-C=O。TPS2在1237.62 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰為S=O的伸縮振動(dòng)峰,表明TPS2為一種硫酸多糖。吡喃糖在1100～1010 cm-1范圍內(nèi)有三個(gè)強(qiáng)吸收峰,呋喃糖在該區(qū)域出現(xiàn)兩個(gè)較強(qiáng)吸收峰[24]。TPS1在1078.98和1025.14 cm-1,以及TPS2在1078.68和1032.60 cm-1出現(xiàn)吸收峰二者都含有呋喃糖環(huán)。TPS1在935.74 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰表明其中可能存在甘露糖。TPS1在855.80、762.70 cm-1處的吸收峰被認(rèn)為是由α-吡喃環(huán)對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)引起的[22,25]。TPS2在878.37 cm-1處為β-構(gòu)型多糖的特征吸收峰[26]。綜上,TPS1中單糖組分可能有甘露糖,且同時(shí)存在α-吡喃環(huán)和呋喃環(huán),TPS2中含有大量糖醛酸和少量蛋白,組成單糖為呋喃糖,成苷的半縮醛羥基主要為β-構(gòu)型。

圖4 TPS1(a)和TPS2(b)的紅外吸收光譜圖

2.3 芋頭水溶性多糖組分對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的影響

2.3.1 芋頭水溶性多糖對(duì)RAW264.7增殖活性的影響 巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)中重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,其功能正常與否直接或間接關(guān)系到免疫應(yīng)答過(guò)程中的抗原呈遞和抗原清除等能力。表2表明實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的TPS1和TPS2對(duì)巨噬細(xì)胞增殖無(wú)毒害作用,TPS1和TPS2均可顯著(P<0.05)提高該細(xì)胞的增殖活力,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展。當(dāng)TPS1和TPS2的濃度分別為50和100 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率最高可達(dá)到120.33%和129.00%,在空白對(duì)照組的基礎(chǔ)上可分別增加20.33%和29.00%,TPS1和TPS2的促增殖作用并不依賴(lài)于濃度大小,具體機(jī)制還有待進(jìn)一步討論。另,同一濃度下,TPS2的促增殖能力均優(yōu)于TPS1。

表2 TPS1和TPS2對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響(%)

2.3.2 芋頭水溶性多糖對(duì)RAW264.7吞噬活性的影響 吞噬功能是巨噬細(xì)胞基礎(chǔ)功能之一,吞噬活性增加被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志[27]。表3表明TPS1在整個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)能夠顯著(P<0.05)促進(jìn)RAW264.7吞噬能力,濃度為200 μg/mL時(shí),細(xì)胞吞噬指數(shù)最高為2.07,為空白對(duì)照組的2.07倍,且顯著(P<0.05)高于LPS處理下的RAW264.7吞噬活性(1.86);TPS2在中低濃度(25～100 μg/mL)能夠顯著(P<0.05)提高吞噬能力,且與濃度呈正相關(guān),表現(xiàn)出濃度依賴(lài)關(guān)系,在濃度為100 μg/mL時(shí)有最大促進(jìn)作用,吞噬指數(shù)為1.57,為空白對(duì)照組的1.57倍,但弱于陽(yáng)性對(duì)照組。當(dāng)TPS2濃度進(jìn)一步增大至200、400 μg/mL,吞噬活性迅速降低,略低于空白對(duì)照組,但差異并不顯著(P>0.05)。分析原因可能是TPS2濃度過(guò)大影響了細(xì)胞滲透壓,導(dǎo)致吞噬活性降低。Li等[6]在對(duì)芋頭多糖的促吞噬作用進(jìn)行研究時(shí),忽略了超純水洗脫組分(即中性多糖的作用,也就是本文中的TPS1),而僅僅證明了0.1 mol/L NaCl洗脫組分(即酸性多糖,也就是本文中TPS2)的促吞噬作用,缺乏對(duì)中性多糖和酸性多糖的促吞噬能力的比較分析。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)TPS1和TPS2的促吞噬作用進(jìn)行研究,各濃度的TPS1處理下的吞噬活性均與空白對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05);相比之下的TPS2僅在中低濃度(25～100 μg/mL)時(shí)表現(xiàn)出顯著的(P<0.05)促進(jìn)作用,其余濃度組分與空白對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。綜上看來(lái),中性多糖TPS1較之酸性多糖TPS2表現(xiàn)出更強(qiáng)的促吞噬活性,這可能是因?yàn)門(mén)PS1中含有的甘露糖,易于與巨噬細(xì)胞表面的甘露糖受體結(jié)合從而促進(jìn)吞噬作用[28]。

表3 TPS1和TPS2對(duì)RAW264.7吞噬指數(shù)(PI)的影響

2.3.3 芋頭水溶性多糖對(duì)RAW264.7合成NO能力的影響 表4表明TPS1和TPS2均能促進(jìn)RAW264.7分泌NO。NO分泌量隨著TPS1濃度的增大而顯著增加(P<0.05),表現(xiàn)出濃度依賴(lài)關(guān)系,TPS1濃度為200 μg/mL時(shí)有最大分泌量26.98 μmol/L,為空白對(duì)照組的3.07倍,但仍低于陽(yáng)性對(duì)照組。TPS2的促進(jìn)作用呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì),存在最佳作用濃度100 μg/mL,此時(shí)的NO分泌量達(dá)40.14 μmol/L,為空白對(duì)照組的4.57倍,且極顯著(P<0.01)高于陽(yáng)性對(duì)照組。當(dāng)TPS2濃度進(jìn)一步增大,NO分泌量雖有降低但仍?xún)?yōu)于TPS1的促進(jìn)作用,且顯著(P<0.05)高于空白對(duì)照組,這說(shuō)明TPS2在合適的濃度下可發(fā)揮出最優(yōu)的促NO分泌作用,一旦濃度過(guò)高,TPS2將以不同的機(jī)制對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生影響,導(dǎo)致NO分泌量降低,這還有待進(jìn)一步的研究。與促進(jìn)吞噬作用不同,同一濃度下,TPS1刺激巨噬細(xì)胞分泌NO的能力弱于TPS2,這將TPS1和TPS2二者在免疫活性調(diào)節(jié)作用上區(qū)分開(kāi),這可能與前文提到的TPS2中含有糖醛酸和硫酸基有關(guān)。Huang等[29]提出含有硫酸基的植物多糖更有利于巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α和IL-1等細(xì)胞因子。

表4 TPS1和TPS2對(duì)RAW264.7分泌NO的影響(μmol/L)

2.3.4 芋頭水溶性多糖對(duì)RAW264.7分泌細(xì)胞因子的影響 細(xì)胞因子作為免疫系統(tǒng)中細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用的信號(hào)分子,起著重要的作用。TNF-α可殺死或抑制腫瘤細(xì)胞[30],能夠加強(qiáng)免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)其它免疫因子的分泌[31];IL-1β可進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞,可參與抗體產(chǎn)生。它們的分泌量可直接反映免疫功能狀況。

表5和表6表明大于25 μg/mL的TPS1和TPS2能不同程度地提高RAW264.7分泌TNF-α和IL-1β的能力。在TPS1的濃度為50 μg/mL時(shí),TNF-α達(dá)到最大分泌量287.10 ng/L,為空白對(duì)照組的3.04倍;TPS1濃度為400 μg/mL時(shí),IL-1β分泌量最大,可增至空白對(duì)照組的1.37倍,分泌量為18.92 ng/L。TPS2的濃度為200 μg/mL時(shí),TNF-α分泌量為空白對(duì)照組的3.76倍,達(dá)到355.33 ng/L;TPS2濃度為100 μg/mL時(shí)IL-1β有最大分泌量21.32 ng/L,為空白對(duì)照組的1.54倍。在TPS1和TPS2兩種芋頭水溶性多糖的作用下,TNF-α的提高程度大于IL-1β。相比于TPS1,TPS2對(duì)細(xì)胞因子的促進(jìn)作用更大,這與前文提到的TPS2中含有較高含量的糖醛酸和硫酸基有關(guān)。有研究表明糖醛酸含量顯著影響酸性多糖的免疫調(diào)節(jié)活性,糖醛酸含量越高,對(duì)細(xì)胞因子的促進(jìn)作用越強(qiáng)[32]。另,硫酸基的存在能夠改變多糖的空間位阻和靜電斥力,提高水溶性[33],使得多糖更容易與巨噬細(xì)胞的受體蛋白結(jié)合,激活下游信號(hào)通路,提高NO及細(xì)胞因子的分泌。

表5 TPS1和TPS2對(duì)RAW264.7分泌TNF-α的影響(ng/L)

表6 TPS1和TPS2對(duì)RAW264.7分泌IL-1β的影響(ng/L)

3 結(jié)論

本文通過(guò)DEAE-52柱層析得到兩種新的芋頭水溶性多糖TPS1和TPS2,Sephadex G-200和SDS-PAGE共同表明TPS1為一種含有甘露糖的α構(gòu)型中性多糖-蛋白復(fù)合物,TPS2為含有硫酸基團(tuán)和大量糖醛酸的β構(gòu)型酸性多糖-蛋白復(fù)合物。體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估發(fā)現(xiàn)TPS1和TPS2都可提高巨噬細(xì)胞吞噬能力,并促進(jìn)NO、TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子的分泌。綜合比較發(fā)現(xiàn),TPS1對(duì)吞噬活性的促進(jìn)作用優(yōu)于對(duì)NO、細(xì)胞因子的促進(jìn)作用,而TPS2具有相反的效應(yīng)。這與二者在組成和結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)。TPS1在935.74 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰初步表明其中含有甘露糖,推測(cè)易與巨噬細(xì)胞甘露糖受體結(jié)合,促進(jìn)吞噬作用;TPS2中在1642.95和1237.62 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,表明其含有大量的糖醛酸和硫酸基團(tuán),這使得它的空間位阻以及靜電斥力發(fā)生變化,利于TPS2與巨噬細(xì)胞的蛋白受體結(jié)合,激活下游信號(hào)通路,促進(jìn)NO和細(xì)胞因子的分泌;其系統(tǒng)完整的構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。綜上,TPS1和TPS2都可作為免疫調(diào)節(jié)劑添加到功能性食品中,為新型的芋頭產(chǎn)品的研發(fā)提高理論依據(jù),進(jìn)而提高芋頭的食用及商業(yè)價(jià)值。