卵泡顆粒細(xì)胞預(yù)測(cè)妊娠相關(guān)生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

蔣雨薇,張梓卉,曾銘華,黨小紅,劉習(xí)明,張 妍

(長(zhǎng)沙生殖醫(yī)學(xué)醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

卵泡細(xì)胞反映了卵母細(xì)胞的整體健康狀況以及胚胎的后續(xù)發(fā)育能力。顆粒細(xì)胞與單個(gè)卵母細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物可用于輔助生殖預(yù)測(cè)何種胚胎最有可能植入子宮并完成妊娠。本綜述中，我們對(duì)近年來涉及胚胎發(fā)育和妊娠有關(guān)的人卵泡顆粒細(xì)胞生物標(biāo)志物進(jìn)行了匯總，對(duì)其微陣列數(shù)據(jù)和定量RT-PCR驗(yàn)證表達(dá)基因的研究進(jìn)行了評(píng)估，提示顆粒細(xì)胞生物標(biāo)記物有助于識(shí)別成熟卵母細(xì)胞以期提高妊娠和活產(chǎn)率。

在過去三十年中我國(guó)輔助生殖技術(shù)雖然有所改進(jìn)，但不孕患者妊娠率和活產(chǎn)率仍不理想。對(duì)于未來的發(fā)展，提高胚胎選擇及植入率是提高生育治療效率的關(guān)鍵。使用激素療法來誘導(dǎo)排卵以及其他用于生產(chǎn)胚胎的技術(shù)包括IVF、ICSI、IMSI及捐贈(zèng)卵子等改進(jìn)的空間不大。缺乏客觀、準(zhǔn)確和無創(chuàng)的胚胎評(píng)估策略仍然是體外受精面臨的主要挑戰(zhàn)之一。隨著胚胎發(fā)展實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)及PGD/PGS技術(shù)的出現(xiàn)，胚胎選擇成為生育治療最有發(fā)展前景的領(lǐng)域。顆粒細(xì)胞反映了卵母細(xì)胞的特性，為評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量提供了一種無創(chuàng)手段。近年來，應(yīng)用qRT-PCR和微陣列技術(shù)，一些研究將顆粒細(xì)胞基因表達(dá)的變化與胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局聯(lián)系起來。本綜述主要評(píng)估卵泡顆粒細(xì)胞的生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)選擇胚胎以期提高體外受精妊娠的成功率。

1 顆粒細(xì)胞生物標(biāo)志物篩選

卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間縫隙連接和旁分泌通訊的相互作用系統(tǒng)為卵母細(xì)胞的發(fā)育、排卵、受精和隨后的植入創(chuàng)造了最佳條件。目前的研究擬用顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜識(shí)別產(chǎn)生高質(zhì)量胚胎的卵母細(xì)胞，以非侵入性的方式準(zhǔn)確地反映卵母細(xì)胞的生育潛能。顆粒細(xì)胞基因標(biāo)志物的研究選擇有不同端點(diǎn)，包括卵母細(xì)胞核成熟期、受精期、第2～3天胚胎期、第5～6天囊胚期、著床期、妊娠和活產(chǎn)期，并根據(jù)妊娠結(jié)局確定胚胎質(zhì)量和能力。迄今發(fā)表的研究表明，qRT-PCR作為一種敏感和有效的方法，廣泛應(yīng)用于單個(gè)轉(zhuǎn)錄樣本的定量。另一方面，利用微陣列技術(shù)進(jìn)行全基因組表達(dá)譜分析，為研究人員開辟了一個(gè)新的視角，有望鑒定出可行胚胎的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志。

2 顆粒細(xì)胞標(biāo)記物與卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育相關(guān)的微陣列及qRT-PCR分析

卵母細(xì)胞的發(fā)育能力是其恢復(fù)成熟、成功受精和達(dá)到囊胚期的能力。這種能力是通過與卵泡的體細(xì)胞相互作用而獲得的。卵丘和顆粒細(xì)胞支持卵母細(xì)胞的發(fā)育，而卵母細(xì)胞則影響卵泡細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。研究表明，卵泡刺激素和黃體生成素通過蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)在顆粒細(xì)胞中啟動(dòng)信號(hào)，在卵母細(xì)胞能力獲得中起重要作用。Tremblay PG等采用基因芯片和RT-qPCR技術(shù)，觀察PKA和PKC刺激對(duì)顆粒細(xì)胞瘤基因表達(dá)的影響[1]。蛋白激酶驅(qū)動(dòng)的信號(hào)涉及五個(gè)主要的上游調(diào)節(jié)，即表皮生長(zhǎng)因子(EGF)[2]，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)[3]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)[4]，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF 2)[5]和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)[6]。與7種主要卵巢功能相關(guān)的基因有：炎性反應(yīng)[7-8]包括前列腺素內(nèi)切酶2(PTGS2)，白細(xì)胞介素8(IL-8)和白細(xì)胞介素6(IL-6)；類固醇生成[9-11]包括立體致敏的急性調(diào)節(jié)蛋白(STAR)、細(xì)胞色素P450家族11亞家族A成員1(CYP11A1)，以及細(xì)胞色素P450家族19亞家族A成員1(CYP19A1)；血管生成[12-14]包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGFC)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)和血管生成C-X-C趨化因子受體四型(CXCR 4)；分化[15-16]包括表皮生長(zhǎng)因子(AREG)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和RTK信號(hào)拮抗劑2(SPRY 2)；細(xì)胞凋亡[17-19]包括BCL 2相關(guān)聯(lián)X(bax)，bcl-樣蛋白12(Bcl2L12)和半胱天冬酶1(CASP 1)；基質(zhì)[20-21]包括細(xì)胞周期蛋白D1(CCND 1)，細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB 1)，細(xì)胞周期蛋白B2(CCNB 2)；排卵[22-23]包括金屬蛋白酶1(MMP1)、金屬肽酶9(MMP 9)和TIMP金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP 1)。

在研究顆粒細(xì)胞基因表達(dá)與體外胚胎發(fā)育的關(guān)系的研究中，McKenzie等人評(píng)估了在108個(gè)人卵泡顆粒細(xì)胞中與卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎質(zhì)量相關(guān)的HAS2、PTGS2和GREM1[24-27]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTGS2和HAS2在發(fā)育為高級(jí)別胚胎的卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)增加了6倍，GREM1的表達(dá)增加了15倍。應(yīng)用qrt-PCR技術(shù)，對(duì)單個(gè)卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞中顯著表達(dá)PTGS2。van Montfoort等人進(jìn)行了基因芯片實(shí)驗(yàn)，比較了8個(gè)卵子早期卵裂胚胎和8個(gè)非早期卵裂胚胎卵母細(xì)胞中的基因表達(dá)[28]，結(jié)果顯示，共有611個(gè)基因有差異表達(dá)，這些基因參與了許多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期、血管生成和凋亡等。在已鑒定的基因中，細(xì)胞周期蛋白D2(CCND 2)[29]、趨化因子受體4(CXCR 4)[14]、谷胱甘肽過氧化物酶3(GPX 3)[30]、鈣黏素相關(guān)蛋白1(CTNND 1)[31]、7-脫氫膽固醇還原酶(DHCR 7)[32]、紊亂節(jié)段極性蛋白3(DVL 3)[33]、熱休克27 kDa蛋白1(HSBP 1)[34]和三重基序28(TRIM 28)[35]是qrt-PCR分析證實(shí)的最重要的基因。這些基因表達(dá)的改變被認(rèn)為是非早期卵裂胚胎缺氧狀態(tài)或卵母細(xì)胞成熟延遲的標(biāo)志。隨后，Assou等人提出了一種基于微陣列基因表達(dá)譜的比較[36]，從而獲得了630個(gè)差異表達(dá)基因研究的鑒定結(jié)果。經(jīng)qRT-PCR證實(shí)bcl-樣蛋白11(BCL2L11)[37]和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(PCK 1)[38]表達(dá)上調(diào)，核因子IB(NFIB)[39]表達(dá)下調(diào)。這些基因有較高的表達(dá)水平，提示顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活對(duì)胚胎的發(fā)育能力至關(guān)重要。以上結(jié)果表明顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析有助于識(shí)別卵母細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)，可能作為新的無創(chuàng)標(biāo)記而替代入侵診斷試驗(yàn)的方法。

3 顆粒細(xì)胞標(biāo)記物與妊娠能力相關(guān)的微陣列及qRT-PCR分析

在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中，應(yīng)考慮基因表達(dá)分析，以確定可能導(dǎo)致妊娠的卵母細(xì)胞[40]。Hamel等人的三項(xiàng)連續(xù)研究報(bào)告了妊娠結(jié)局與顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體之間的關(guān)系[41-43]。在其研究中，使用cDNA微陣列和基因芯片，對(duì)顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。從代表孕婦和非孕婦患者的集合樣本中提取的消減文庫中提取定制微陣列包含顆粒細(xì)胞表達(dá)的序列標(biāo)簽(EST)。在115個(gè)差異表達(dá)基因中，3-β-羥色胺脫氫酶(HSD 3β1)[44]的表達(dá)發(fā)生了改變，鐵氧還蛋白1(FDX 1)[45]，絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑類成員2(SERPINE2)[46]、細(xì)胞色素P450芳香化酶(CYP19A1)[11]和細(xì)胞分裂周期42(CDC42)[47]與妊娠結(jié)局顯著相關(guān)。利用這項(xiàng)初步研究的結(jié)果，研究人員隨后確定了磷酸甘油酸激酶1(PGK 1)[48]、G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子(RGS 2、RGS 3)[49-50], CDC42和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP 2)[51]以及血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源結(jié)構(gòu)域A族成員1(PHLDA 1)[52]，作為與胚胎質(zhì)量相關(guān)致妊娠成功的潛在標(biāo)記。

綜上所述，與卵母細(xì)胞相關(guān)的顆粒細(xì)胞是鑒定生物標(biāo)志物的有價(jià)值的來源，從而可靠地選擇能夠?qū)е禄町a(chǎn)的胚胎。在評(píng)估顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)的研究中所發(fā)表的結(jié)果顯示，對(duì)顆粒細(xì)胞作為卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育和質(zhì)量標(biāo)記物的共識(shí)是有限的。這可能是由于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、研究結(jié)果指標(biāo)、研究群體的規(guī)模和利用技術(shù)的變化造成的。此外，在評(píng)估卵泡顆粒細(xì)胞有關(guān)胚胎質(zhì)量和其他生殖終點(diǎn)的微陣列和qRT-PCR數(shù)據(jù)時(shí)，主要的困難之一是患者群體的異質(zhì)性。影響體外受精結(jié)局和基因表達(dá)的患者特征包括年齡、體重指數(shù)(BMI)、診斷、刺激類型、刺激過程中的激素水平和卵母細(xì)胞產(chǎn)量等，因此選擇患者是鑒別顆粒細(xì)胞預(yù)測(cè)妊娠的生物標(biāo)記物的關(guān)鍵。由于IVF患者在尋找潛在的生物標(biāo)志物時(shí)要考慮許多不同的特點(diǎn)，逐步多因素分析可能是選擇子宮移植胚胎最有希望的方法。雖然許多研究都集中在授精成熟卵母細(xì)胞的結(jié)果上，但在子宮移植時(shí)并不能保證被評(píng)估的胚胎在基因上是正常的。顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄與植入前遺傳篩查PGS的結(jié)合可能是改善子宮移植胚胎選擇的下一步，因?yàn)檫@將認(rèn)可胚胎倍性狀態(tài)及基因表達(dá)生物標(biāo)志物與活產(chǎn)的關(guān)系。顆粒細(xì)胞生物標(biāo)志物也可能有更多的應(yīng)用，鑒于許多成熟卵母細(xì)胞在形態(tài)上相似，顆粒細(xì)胞生物標(biāo)記物有助于識(shí)別成熟卵母細(xì)胞。在將來，顆粒生物標(biāo)志物可能會(huì)在卵母細(xì)胞受精之前進(jìn)行評(píng)估，只選擇那些能夠?qū)е禄町a(chǎn)的卵母細(xì)胞去受精，以期提高妊娠和活產(chǎn)率。