CDCA3在下咽鱗癌中的表達(dá)及臨床意義

吳俊福 代立媛 崔萌 杜偉 劉善廷 婁衛(wèi)華

下咽鱗癌的惡性程度較高，5年總生存率僅為15%～45%，近幾十年無(wú)較大的改善［1］，在治療上具有挑戰(zhàn)性。下咽鱗癌侵襲性強(qiáng)，早期易發(fā)生黏膜下擴(kuò)散，頸部轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高。據(jù)報(bào)道約60%～80%患者發(fā)生同側(cè)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，40%患者有對(duì)側(cè)頸部淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移，而且疾病的早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是影響預(yù)后的重要因素［2］。因此，尋找與下咽鱗癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物對(duì)研究其發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為及治療具有十分重要的臨床意義。

細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和分裂是包括下咽鱗癌在內(nèi)的所有惡性腫瘤的共同特征。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的不適當(dāng)表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［3］。大量研究報(bào)道了癌變與細(xì)胞周期相關(guān)基因的關(guān)系。特別是近期的研究表明，對(duì)G1/S 階段靶點(diǎn)的Skp1-cullin-F-box（SCF）控制的放松也可能有助于腫瘤的發(fā)生。作為SCF 組分之一的細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白3（cell division cycle associated protein 3，CDCA3）與腫瘤的關(guān)系近年來(lái)受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，CDCA3在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤預(yù)后存在密切的關(guān)系，有可能成為治療的新靶標(biāo)。但是CDCA3在下咽鱗癌中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究從Oncomine腫瘤芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中的腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集中分析得到CDCA3 在頭頸部鱗癌及癌旁正常組織中存在DNA 表達(dá)差異，結(jié)合患者的臨床病理特征及隨訪資料，分析CDCA3 與下咽鱗癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

下咽鱗癌組織和癌旁正常黏膜組織均取自2018年9月至2019年9月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的15 例下咽鱗癌患者（表1）。切除的組織標(biāo)本在手術(shù)離體后快速冷凍，液氮保存。其它腫瘤組織進(jìn)行常規(guī)病理診斷。并擴(kuò)大樣本量收集臨床資料完整的80 例下咽鱗癌患者的石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。標(biāo)本選自2010年7月到2015年7月本院手術(shù)的下咽鱗癌患者。所有入選病例均符合條件：1）術(shù)前未進(jìn)行放、化療的初治患者；2）術(shù)后病理診斷為下咽鱗癌；3）接受包括手術(shù)切除在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)治療。所有病例臨床資料均完整可靠，均簽署書(shū)面知情同意書(shū)，獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者通過(guò)門(mén)診或住院就診、電話、微信等方式隨訪，確診時(shí)間為起點(diǎn)，均進(jìn)行5年隨訪，期間若有腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡則終止隨訪。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及抗體 RNA提取試劑盒購(gòu)自上海普飛公司，M-MLV 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司，BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海Beyotime 公司，dNTPs購(gòu)自美國(guó)Promega公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa-Cruz 公司，CDCA3 抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 1）qRT-PCR檢測(cè)CDCA3在下咽鱗癌和癌旁組織中的mRNA 表達(dá)：CDCA3 引物長(zhǎng)度為261 bp，上游引物為5′-ATTGCACGGACACCTATGA-3′，下游引物為5′-TGTGGGCTGTCTTGCTTC-3′。GAPDH的引物長(zhǎng)度為121 bp，上游引物為5′-TGACTTCAACAG CGACACCCA-3′，下游引物為5′-CACCCTGTTGCTGT AGCCAAA-3′。取15例下咽鱗癌組織和癌旁正常黏膜組織，Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，使用2-△△cT法計(jì)算并分析CDCA3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2）應(yīng)用Western blot 法檢測(cè)CDCA3 在下咽鱗癌和癌旁組織中的蛋白表達(dá)：隨機(jī)選取5對(duì)下咽鱗癌組織和癌旁正常黏膜組織檢測(cè)CDCA3 蛋白表達(dá)水平。組織樣品在冰上剪碎后用RIPA 裂解液提取蛋白質(zhì)，用BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司）定量。將提取的蛋白樣品用SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用特定的一抗和適當(dāng)?shù)亩惯M(jìn)行免疫印跡。使用ECL-PLUS試劑盒檢測(cè)蛋白條帶。

3）采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CDCA3在下咽鱗癌中的表達(dá)：將80 例下咽鱗癌石蠟塊連續(xù)切片，切片厚度約4 μm，置入60℃烘箱內(nèi)烤片。在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)之前，梯度酒精中水化。切片與抗CDCA3（1:150 稀釋度）一抗在4℃下孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次后，將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗在37℃孵育1 h。本院病理科兩位病理醫(yī)師各自在光學(xué)顯微鏡下判讀所有的IHC 染色切片。根據(jù)細(xì)胞染色的強(qiáng)弱直觀評(píng)分：0 分陰性（無(wú)染色），1 分弱陽(yáng)性（淡黃色），2分陽(yáng)性（棕黃色），3分強(qiáng)陽(yáng)性（棕色）。陽(yáng)性細(xì)胞染色率評(píng)分：0分（＜5%），1分（5%～30%），2分（31%～50%），3分（5l%～75%），4分（＞75%）。CDCA3染色評(píng)分由CDCA3 染色強(qiáng)度與百分比總分之和確定。總分≥4分為CDCA3陽(yáng)性表達(dá)，總分＜4分為陰性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)為計(jì)數(shù)資料，組間比較用χ2檢驗(yàn)。生存率估計(jì)采用Kaplan-Meier法，生存時(shí)間間比較用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。單因素Cox 回歸模型分析影響預(yù)后的因素，多因素Cox 回歸模型進(jìn)一步分析影響預(yù)后的因素。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均為雙側(cè)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDCA3 DNA拷貝數(shù)在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)

在Oncomine 腫瘤芯片數(shù)據(jù)庫(kù)的TCGA 數(shù)據(jù)集中進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示CDCA3 在頭頸鱗癌組織和正常組織之間差異顯著，相比全血及頭頸部正常組織，CDCA3的DNA拷貝數(shù)在頭頸鱗癌組織中顯著上調(diào)（P=3.81E-13，圖1）。

2.2 CDCA3 mRNA及蛋白在下咽鱗癌組織中的表達(dá)

通過(guò)在Oncomine腫瘤芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行差異分析，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR 檢測(cè)了15對(duì)新鮮下咽鱗癌組織及癌旁正常黏膜中CDCA3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示與配對(duì)癌旁正常下咽黏膜相比，下咽鱗癌組織中CDCA3 的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。同時(shí)隨機(jī)選擇5 對(duì)下咽鱗癌及癌旁正常組織應(yīng)用Western blot法檢測(cè)CDCA3的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示CDCA3在下咽鱗癌組織中的相對(duì)蛋白表量較癌旁正常組織顯著升高（圖3）。

表1 15例下咽鱗癌患者的臨床特征

圖1 CDCA3 基因的DNA 拷貝數(shù)在頭頸鱗癌組織、全血及正常頭頸部組織中的表達(dá)

2.3 CDCA3在下咽鱗癌中的表達(dá)與臨床病例特征的相關(guān)性分析

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)80例患者的臨床病理特征（表2）。CDCA3在下咽鱗癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示CDCA3 蛋白主要在胞質(zhì)中表達(dá)（圖4）。CDCA3 在81.2%（65/80）的下咽鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)，在18.8%（15/80）陰性表達(dá)。分析CDCA3 與下咽鱗癌臨床病理特征的關(guān)系（表3），結(jié)果表明T1～T2 組CDCA3 的相對(duì)表達(dá)水平低于T3～T4 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CDCA3的相對(duì)表達(dá)水平低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ⅰ+Ⅱ期組中CDCA3 的相對(duì)表達(dá)水平低于Ⅲ+Ⅳ期組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CDCA3 的相對(duì)表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤的原發(fā)部位、吸煙飲酒史、病理分級(jí)等無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

圖2 CDCA3 mRNA在下咽鱗癌組織及癌旁正常組織的表達(dá)

圖3 CDCA3蛋白在下咽鱗癌組織及癌旁組織的表達(dá)

2.4 CDCA3表達(dá)與下咽鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果提示，CDCA3表達(dá)上調(diào)與生存時(shí)間顯著相關(guān)。CDCA3陽(yáng)性表達(dá)組患者的總生存期顯著低于CDCA3陰性表達(dá)組（P=0.001，圖5）。CDCA3陽(yáng)性表達(dá)病例組5年生存率為16.4%，而CDCA3陰性表達(dá)病例組為35.6%。單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析提示，CDCA3 表達(dá)、腫瘤大小、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的因素。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析表明，CDCA3表達(dá)是影響下咽鱗癌患者生存狀態(tài)的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05），而腫瘤大?。═分期）、區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期均不能作為患者的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素，其協(xié)同發(fā)揮作用影響下咽鱗癌患者的預(yù)后（表4）。

表2 80例下咽鱗癌患者的臨床病理特征

圖4 CDCA3在下咽鱗癌中的表達(dá)（IHC×100）

表3 下咽鱗癌組織中CDCA3 的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 例

圖5 CDCA3表達(dá)水平與下咽鱗癌患者預(yù)后之間的關(guān)系

表4 下咽鱗癌患者預(yù)后相關(guān)因素的單因素及多因素Cox回歸分析

3 討論

CDCA3 也稱為T(mén)ome-1（有絲分裂進(jìn)入的觸發(fā)器）。CDCA3含有1個(gè)F-box基序，可與Skp1和cullin結(jié)合，通過(guò)刺激某些蛋白質(zhì)如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的降解來(lái)調(diào)節(jié)人體內(nèi)的許多生理和病理過(guò)程。最近的研究表明，CDCA3 在各種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［4-13］，并且與腫瘤預(yù)后存在密切的關(guān)系，可能是一種致癌F-box 蛋白，有可能成為治療腫瘤的新靶標(biāo)。

Itzel 等［11］在對(duì)163 種腫瘤的微陣列數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)嚴(yán)密調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)，包括具有預(yù)后重要性的CDCA3。該研究通過(guò)RT-qPCR 法驗(yàn)證了生物信息學(xué)分析結(jié)果，并證明與正常組織中的表達(dá)水平相比，CDCA3 在乳腺癌、腎癌、肺癌和卵巢癌中的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。目前，鮮見(jiàn)CDCA3 在下咽鱗癌中的報(bào)道，其表達(dá)情況與下咽鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系以及可能的作用機(jī)制不清。本研究首先應(yīng)用qRT-PCR 及Western blot 技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，下咽鱗癌組織中CDCA3的表達(dá)與癌旁組織相比在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均明顯上調(diào)，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，在80 例下咽鱗癌組織標(biāo)本中，65 例標(biāo)本CDCA3 陽(yáng)性表達(dá)，與CDCA3 在胃癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、口腔鱗癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)情況一致［4，6-10］。Qian等［8］對(duì)結(jié)直腸癌組織中CDCA3表達(dá)與臨床病理因素進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，CDCA3 的高表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)侵犯顯著相關(guān)。Zhang等［4］研究胃癌組織中CDCA3的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，CDCA3高表達(dá)與腫瘤大小、分化程度、原發(fā)腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)。本研究結(jié)合80 例下咽鱗癌中CDCA3 表達(dá)情況，分析CDCA3 陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CDCA3陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期顯著相關(guān)。上述研究結(jié)果均提示CDCA3 陽(yáng)性表達(dá)與下咽鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，CDCA3可能在下咽鱗癌中起到癌基因的作用。

下咽癌由于其發(fā)病位置較深且隱蔽，早期癥狀不典型，出現(xiàn)癥狀后就診的下咽癌患者中，超過(guò)70%患者為Ⅲ期和Ⅳ期［14］，腫瘤往往已經(jīng)向周?chē)M織器官侵犯，如喉、舌根、食管等部位，同時(shí)伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。Hall等［15］開(kāi)展的一項(xiàng)包括595例下咽癌的臨床研究發(fā)現(xiàn)，接受治療的患者中20%有殘留，47%患者在3年后腫瘤無(wú)復(fù)發(fā)，50%患者在治療后的第1年內(nèi)復(fù)發(fā)，其中50%出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。下咽鱗癌的惡性程度較高，治療上具有挑戰(zhàn)性，術(shù)后常造成呼吸和吞咽等功能受損。影響下咽鱗癌的預(yù)后因素較多，如腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期等因素，為了研究CDCA3 是否與下咽鱗癌預(yù)后相關(guān)，本研究應(yīng)用單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析發(fā)現(xiàn)，CDCA3的陽(yáng)性表達(dá)、腫瘤大小、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的因素，經(jīng)過(guò)多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，表明CDCA3表達(dá)是影響下咽鱗癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素，而原發(fā)腫瘤大小（T 分期）、區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM 分期均不能作為預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其協(xié)同作用影響下咽鱗癌患者的預(yù)后。進(jìn)一步證明了CDCA3參與了下咽鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。然而，CDCA3在下咽鱗癌中的促癌作用的具體機(jī)制及分子通路尚未明確，將是后續(xù)研究工作的主要方向。

綜上所述，CDCA3 在下咽鱗癌組織中表達(dá)顯著增加，其陽(yáng)性表達(dá)與患者的原發(fā)腫瘤大小、TNM分期以及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。而且下咽鱗癌CDCA3的陽(yáng)性表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究結(jié)果表明CDCA3在下咽鱗癌中可能起到癌基因的作用，可能成為下咽鱗癌分子治療的新靶點(diǎn)。