高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定芒果中六種鏈格孢霉毒素殘留

張子庚,張愛芝,邢家溧,*,承 海,張書芬,鄭睿行,戴賢君

(1.中國計量大學生命科學學院,浙江杭州 310018;2.寧波市食品檢驗檢測研究院,浙江寧波 315048)

芒果富含維生素C和膳食纖維,營養(yǎng)價值高,其產(chǎn)量位居世界水果前列[1],研究表明芒果易受多種病原菌的侵害,特別是鏈格孢霉屬真菌,這是造成芒果腐爛的主要原因。鏈格孢霉菌屬絲狀真菌,廣泛存在低溫潮濕環(huán)境之中,是引起水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品腐爛變質(zhì)的主要微生物之一[2]。鏈格孢霉毒素是鏈格孢霉菌分泌的次級代謝產(chǎn)物,對人及動物具有急性、慢性毒性以及“三致”反應等多種危害。目前已鑒明的鏈格孢霉毒素約有70余種,從結構上區(qū)分主要可分為五類[3]:第一類為二苯并吡喃酮類及其衍生物,主要包括鏈格孢酚(Alternariol,AOH)、交鏈格孢酚單甲醚(Alternariol mono-methyl ether,AME)和交鏈孢烯(Altenuene,ALT);第二類為四氨基酸衍生物類,代表毒素為細交鏈格孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)及異細交鏈孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid,iso-TeA);第三類為二萘嵌苯醌類,包括ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ、ATX-Ⅲ等一類衍生物;第四類為丙三羧酸酯類化合物,即AAL毒素,又可分為AAL-TA和AAL-TB兩大類;第五類為包括騰毒素(Tentoxin,Ten)在內(nèi)的其它結構類型。目前關于鏈格孢霉毒素主要針對柑橘類[4]、番茄類[5]、瓜類[6]、藍莓漿果[7]以及啤酒[8]等開展的檢測研究,而且研究的毒素種類也主要集中在AOH、AME、TeA、ALT、Ten等[9],關于芒果中鏈格孢霉毒素檢測方法和污染現(xiàn)狀的研究相對較少,因此建立芒果中多種典型鏈格孢霉毒素的檢測方法,對了解芒果中鏈格孢霉毒素污染狀況具有重要的意義。

隨著對鏈格孢霉毒素毒理學研究的不斷深入,對鏈格孢霉毒素的危害影響逐漸明晰,人們的危害風險防范意識也逐步加強,但迄今為止,國內(nèi)尚未建立相應的食品衛(wèi)生標準及檢測方法標準。現(xiàn)有研究所涉及的鏈格孢霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法[10]、毛細管電泳法[11]、酶聯(lián)免疫吸附法[12]、氣相色譜法[13]、液相色譜法[14]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16]等。薄層色譜法操作過程繁瑣,靈敏度低、準確度差;氣相色譜法以及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法無法分離和檢測不能氣化和熱不穩(wěn)定的物質(zhì),由于大部分鏈格孢霉毒素比較穩(wěn)定,揮發(fā)性差,所以氣相色譜法以及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法很少用于鏈格孢霉毒素的檢測研究;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有快速、精密度高、靈敏度高等優(yōu)點,與液相色譜法相比,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可達到同時定性定量,是目前研究鏈格孢霉毒素重點采用的方法。目前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法常采用固相萃取、QuEChERS等前處理方法與之聯(lián)用[17]。固相萃取操作過程較為繁瑣,且部分毒素如AOH回收率低,不適合采用固相萃取進行前處理。而QuEChERS操作簡單快速,回收率高,環(huán)境污染小[18],但現(xiàn)有文獻中QuEChERS方法用于芒果中鏈格孢霉毒素的檢測較少。基于此,本研究擬利用改進的QuEChERS前處理技術結合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立快速檢測芒果中6種典型鏈格孢霉毒素AOH、AME、ALT、Ten、TeA和細格菌素(Altenusin,ATS)的方法。針對本文芒果樣品基質(zhì),考察了帶皮芒果與無皮芒果2種基質(zhì),分別對液質(zhì)法的儀器條件種改進的QuEChERS萃取條件進行改進優(yōu)化,并將該方法用于實際芒果樣品檢測中，旨在開發(fā)一種定性準確、靈敏度高、分析時間短、前處理簡單、重現(xiàn)性好的方法,為芒果中鏈格孢霉毒素污染狀況研究提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貴妃芒 當?shù)爻?取不同成熟度的芒果(新鮮、稍有腐爛、腐爛嚴重);AOH、AME、ALT、Ten、TeA、ATS標準品 上海安譜實驗科技股份有限公司;乙腈、甲酸、乙酸 色譜純,德國Merck公司;無水MgSO4、NaCl 國藥集團化學試劑有限公司。

ACQUITY UPLC I-CLASS(色譜型號)Waters XeVO TQ-XS(質(zhì)譜型號)液質(zhì)聯(lián)用儀 配有電噴霧離子源(ESI),美國Waters公司;TGL-20M 高速臺式冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;Vortex 3 自動漩渦混合器 德國IKA公司;Milli-Q型超純水機 電阻率為18.2 MΩ·cm,美國Millipore公司;KS-300EI超聲波清洗機 寧波科生設備有限公司;SW22振蕩水浴鍋 德國Julabo公司;AH-30全自動均質(zhì)器 ?？苾x器有限公司;0.22 μm有機濾膜 北京捷盛依科科技有限公司;ME204E電子天平 實際分度值為0.0001 g,上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器條件

1.2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫40 ℃;流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～5.0 min,90%～5% A;5.0～7.0 min,5% A;7.0～7.5 min,5%～90% A;7.5～10.0 min,90% A;0～5.0 min,10%～95% B;5.0～7.0 min,95% B;7.0～7.5 min,95%～10% B;7.5～10.0 min,10% B。此處百分比均為體積比。進樣量為5 μL;流速為0.40 mL/min。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源為正離子模式(ESI+);質(zhì)譜掃描模式為多反應監(jiān)測模式(MRM);毛細管電壓:1.08 kV;錐孔電壓:25 V;射頻透鏡1(RF lens 1)和射頻透鏡2(RF lens 2)的電壓均為15.0 V;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑溫度:600 ℃;脫溶劑氣流量:1000 L/h;錐孔反吹氣:150 L/h。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子對。

1.2.2 標準溶液的配制 標準儲備液:分別準確稱取TeA、AME、AOH、Ten、ALT和ATS標準品0.001 g溶于10 mL乙腈中,配制成100 μg/mL的標準混合液,取100 μg/mL的標準混合液100 μL用乙腈溶解并定容至10 mL,得到1 μg/mL的標準儲備液,密封后置于-20 ℃保存。

標準工作液:用乙腈與水(V∶V=1∶1)將標準儲備液逐級配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的6種鏈格孢霉毒素的混合標準溶液。

1.2.3 樣品前處理方法 樣品前處理方法依據(jù)參考文獻[19-20]并加以改進:分別稱取攪碎勻漿的帶皮芒果全果和去皮芒果各5.00 g(精確到0.01 g)于50 mL尖底具塞離心管內(nèi),加入3 mL一級水,5 mL 1.5%甲酸-乙腈溶液,2 g無水MgSO4后,渦旋振蕩10 min,在9500 r/min下離心5 min,取全部上清液于新的50 mL尖底具塞離心管,加入0.3 g NaCl渦旋3 min,再次在9500 r/min下離心5 min,取上清液500 μL,加500 μL一級水,渦旋混勻,過0.22 μm有機濾膜,上機測定。

2 結果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法常用的流動相體系為水-甲醇、水-乙腈,在正離子采集模式下,甲酸、甲酸銨的引入通常會增強目標物響應、改善目標物峰型,因本實驗前處理方法采用甲酸-乙腈為提取劑,并通過水稀釋過膜后直接上機分析,為保持一致,本實驗重點考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸+5 mmol甲酸銨溶液-乙腈3種流動相體系。結果表明,因采用正離子采集模式,甲酸的引入會使6種目標鏈格孢霉毒素響應增強,而甲酸銨引入后目標物響應降低且峰型會出現(xiàn)一定的拖尾,因而選用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相體系(圖1)。

圖1 6種鏈格孢霉毒素MRM離子質(zhì)譜圖

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 通過流動注射泵連續(xù)進樣方式進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化,確定各鏈格孢霉毒素的錐孔電壓、碰撞電壓、離子源溫度、去溶劑氣溫度及流量、碰撞氣流量及定性定量離子等質(zhì)譜參數(shù),使每種目標物的離子化效率達到最佳。分別用ESI+和ESI-模式對樣品進行全掃描,找出響應值較大的離子為母離子,結果表明:在電噴霧ESI+模式下,6種鏈格孢霉毒素靈敏度響應值高,TeA、AME、AOH、Ten、ALT和ATS母離子m/z為415.4、273.2、259.2、198.2、293.2和291.2。進一步改變碰撞電壓,進行二次質(zhì)譜掃描,找出信號較強且穩(wěn)定性較強的子離子(表1)。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 QuEChERS方法萃取條件的優(yōu)化

QuEChERS方法最早由美國M.Aanstassiads等人建立,用于水果、蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法。其技術核心是在水果、蔬菜的提取液中直接加入除水劑和雜質(zhì)吸附劑,經(jīng)離心后直接進行色質(zhì)聯(lián)用分析[21]。為提高檢測效率,本文借鑒QuEChERS方法,將研究重點放在尋求簡單高效的樣品前處理上。在優(yōu)化實驗條件的過程中樣品基質(zhì)分別為帶皮芒果全果和去皮芒果。

2.2.1 樣品量對6種鏈格孢霉毒素回收率影響的優(yōu)化 本研究分別考察了1、2、5、8和10 g樣品量對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響。具體結果如圖2、圖3所示,當樣品量為1 g時,兩種基質(zhì)中6種鏈格孢霉毒素回收率均過低;當樣品量為2 g時,6種鏈格孢霉毒素回收率均不高,其中去皮芒果AME、TeA和ATS的回收率僅為35%、60%和27%左右,并且精密度和重復性較差,兩種基質(zhì)中6種鏈格孢霉毒素的RSD均高達10%以上;當樣品量為5、8和10 g時,6種鏈格孢霉毒素的回收率均高于85%,其中帶皮芒果AOH和ALT的回收率高達90%以上,兩種基質(zhì)中6種鏈格孢霉毒素RSD均較小。從經(jīng)濟環(huán)保的角度考慮,最終選擇芒果樣品基質(zhì)的取樣量為5 g。

圖2 帶皮芒果中樣品量對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響

圖3 無皮芒果中樣品量對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響

2.2.2 加水量對6種鏈格孢霉毒素回收率影響的優(yōu)化 本文課題組曾詳細研究過采用QuEChERS-液質(zhì)聯(lián)用法快速篩查水果和蔬菜中多種農(nóng)藥的殘留檢測,發(fā)現(xiàn)在水分較少的蔬菜和水果中加入一定量的水,提取效果較好[22]?？紤]到芒果甜度高,黏度大,加入除水劑后提取效果不好,所以加入一定量的水,可以增加回收率。本研究詳細研究了加水量對提取效率的影響,分別選取了0、1、2、3、4、5 mL的加水量對提取效率的影響,具體結果如圖4和圖5所示,發(fā)現(xiàn)在5 g芒果基質(zhì)中加入3 mL水的提取效果最好。究其原因可能因為水的加入可以使乙腈更好的浸入到樣品內(nèi)部,從而提高提取效果[23]。

圖4 帶皮芒果中加水量對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響

圖5 去皮芒果中加水量對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響

2.2.3 提取劑選擇及其用量對6種鏈格孢霉毒素回收率影響的優(yōu)化 TeA是一種酸,因此在對其提取時樣品提取液中加入適量酸有利于TeA的提取[24],本實驗分別比較了純乙腈溶液以及濃度為1%、1.5%和2%的乙酸-甲醇溶液、甲酸-乙腈溶液和乙酸-乙腈溶液的提取效果,結果發(fā)現(xiàn):純乙腈溶液作為提取劑時,回收率較低;乙酸-甲醇溶液作為提取劑時,提取液較為渾濁,且樣品回收率較低,最高回收率也只有20%左右;而乙酸-乙腈溶液和甲酸-乙腈溶液提取的提取液的清澈程度和樣品回收率遠好于乙酸-甲醇溶液以及純乙腈溶液,其中1.5%甲酸-乙腈溶液效果最佳,如圖6所示。

圖6 1.5%甲酸-乙腈溶液提取時6種鏈格孢霉毒素的回收率

本實驗進一步考察了1.5%甲酸-乙腈溶液的用量對6種鏈格孢霉毒素提取效果的影響,分別加入5、10和15 mL的1.5%甲酸-乙腈溶液,實驗結果發(fā)現(xiàn)加入15 mL提取劑時6種鏈格孢霉毒素的響應值最大,加入5 mL提取劑時的響應值最小,并且加入15 mL提取液的樣品回收率最高,但是10和15 mL所得到的回收率在102%～140%范圍內(nèi),而5 mL所得到的6種鏈格孢霉毒素回收率在80%～96%范圍內(nèi)。因此本次研究選取5 mL的1.5%甲酸-乙腈溶液作為提取劑。

2.2.4 無水MgSO4、NaCl用量和吸附劑對6種鏈格孢霉毒素回收率影響的優(yōu)化 QuEChERS-液質(zhì)聯(lián)用法中經(jīng)常使用的除水劑主要有MgSO4、Na2SO4和MgCl2等,其中無水MgSO4的除水效果更好[25]。因此本實驗分別比較了1、2、3、4和5 g的無水MgSO4用量對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響。實驗結果如圖7、圖8所示,研究表明2 g無水MgSO4相較于其他用量的無水MgSO4所得到的回收率效果最佳,加入3 g以上無水MgSO4時對提取效果有抑制作用。因此確定無水MgSO4的用量為2 g。

圖7 無水MgSO4用量對帶皮芒果中6種鏈格孢霉毒素回收率的影響

圖8 無水MgSO4用量對去皮芒果中6種鏈格孢霉毒素回收率的影響

鹽析劑的存在可以大大提高萃取效率,本實驗考察了鹽析劑NaCl 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g三種用量對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響。實驗結果表明NaCl用量為0.2 g時,6種鏈格孢霉毒素回收率不高;0.3 g和0.4 g NaCl用量對6種鏈格孢霉毒素的回收率均達到80%以上;NaCl用量為0.5 g時,回收率在112%～156%范圍內(nèi)。因此選擇NaCl用量為0.3 g。本實驗又比較了NaCl加入的時間(在離心前加入和離心后)對提取效果的影響,研究發(fā)現(xiàn)在離心后取上清液加入0.3 gNaCl,再次離心后提取上清液過膜回收率更高。

當樣品被提取鹽析出來的時候,難免有芒果樣品中的一些成分,如少量蛋白質(zhì)、油脂以及色素與鏈格孢霉毒素被一起萃取出來,可能會干擾最終的實驗結果?？紤]到這6種鏈格孢霉毒素是平面結構,而石墨化碳黑吸附劑GCB也是平面結構,GCB會吸附鏈格孢霉毒素[26],所以不考慮GCB。本實驗進一步考察了C18、PSA兩種吸附劑對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響,發(fā)現(xiàn)加入C18后TeA的回收率為40%～50%,加入PSA與不加任何吸附劑對6種鏈格孢霉毒素的回收率影響不顯著,甚至加入PSA后TeA的回收率低于不加任何吸附劑的樣品。所以本實驗不加入任何吸附劑。

2.2.5 提取方式對6種鏈格孢霉毒素回收率影響的優(yōu)化 本實驗考察了均質(zhì)(12000 r/min,5 min)、渦旋振蕩(10 min)、超聲波(20 min)和水浴振蕩(40 ℃,20 min)4種提取方式對6種鏈格孢霉毒素回收率的影響。實驗結果如圖9所示,研究表明,采用均質(zhì)提取時,帶皮芒果全果ALT、TeA提取回收率分別為30%、13%,去皮芒果ALT、TeA提取回收率為40%、18%;超聲波提取時,TeA、AOH和ALT的回收率均低于40%;水浴振蕩提取時,帶皮芒果全果TeA的回收率為43%,去皮芒果TeA的回收率僅為7%;在渦旋振蕩提取時,樣品回收率均高于85%。因此本實驗還進一步研究了振蕩時間(1、5、10、20、30 min)對6種鏈格孢霉毒素回收率效果的影響,發(fā)現(xiàn)振蕩1 min時,6種鏈格孢霉毒素回收率效果較差;振蕩5 min時,TeA和ATS的回收率不高;10、20、30 min振蕩對回收率的影響相差不顯著,且6種鏈格孢霉毒素回收率效果均較好。因此,本研究選擇渦旋振蕩10 min作為提取方式。

圖9 4種提取方式對帶皮芒果與去皮芒果中6種鏈格孢霉毒素回收率影響

2.3 基質(zhì)效應的考察

基質(zhì)效應是指樣品中除目標化合物以外的其它成分對目標化合物響應值的影響[27],是殘留檢測中普遍存在的現(xiàn)象,通常通過向陰性樣品處理液中添加目標化合物與同濃度標準溶液響應的對比,來進行基質(zhì)效應的考察。本文考察了稀釋及小體積進樣在減弱或消除基質(zhì)效應方面的作用。

稀釋可以有效的減小樣品的基質(zhì)效應。通常將加標樣品稀釋,若稀釋后的響應值與稀釋前相比成比例減小,則說明基本不存在基質(zhì)效應。若不成相應比例,明顯偏大說明存在基質(zhì)抑制作用,明顯偏小存在基質(zhì)增強作用。本實驗采用1.5%甲酸-乙腈溶液進行提取,除水鹽析之后,鏈格孢霉毒素保留在提取液當中,直接上機基質(zhì)效應嚴重且有部分溶劑效應,用與提取液同等體積的一級水進行稀釋,消除溶劑效應和部分基質(zhì)效應。用與提取液同等體積的一級水進行稀釋,消除溶劑效應和部分基質(zhì)效應。帶皮芒果全果和去皮芒果稀釋1倍前后6種鏈格孢霉毒素響應值如表2所示,通過比較,6種鏈格孢霉毒素中ALT、Ten、ATS以及帶皮芒果全果AME存在基質(zhì)增強作用,TeA、AOH以及去皮芒果中AME存在基質(zhì)抑制作用。

表2 帶皮芒果全果和去皮芒果稀釋1倍前后6種鏈格孢霉毒素響應值

李紅娥[28]發(fā)現(xiàn)小體積進樣對基質(zhì)效應有較好的效果,因此本研究采用不同的進樣體積(1、3、5 μL)考察對基質(zhì)效應的影響,結果表明,5 μL進樣體積時基質(zhì)消除不明顯,1 μL與3 μL進樣體積時基質(zhì)消除效果相近,但考慮到1 μL進樣體積太少,容易導致進樣柱不準,實驗不好控制,最終選取進樣體積3 μL。

2.4 方法學評價

2.4.1 線性關系和檢出限 將6種鏈格孢霉毒素用乙腈配制成1 μg/mL的混合標準儲備溶液用乙腈∶水(v∶v=1∶1)逐級配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的標準工作液,供上機使用。

注：ND:未檢出。

當6種目標物相關系數(shù)均大于0.990,表明各目標物在該濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關系。結果如表3所示,6種鏈格孢霉毒素在0.5～200 ng/mL范圍內(nèi)均有良好的線性關系,采用向?qū)嶋H樣品中逐級降低加標濃度的方式進行,經(jīng)過前處理,上機分析,做9次均能獲得較好峰型,以S/N=3作為檢出限,6種鏈格孢霉毒素的檢出限在0.6～3.0 μg/kg范圍內(nèi)。

表3 6種鏈格孢霉毒素的線性范圍、線性方程、R2和檢出限

2.4.2 加標回收率和精密度 在5 g芒果空白樣品中分別加入3個濃度(5、10、20 μg/kg)的6種鏈格孢霉毒素標準溶液,每個濃度水平重復測定5次。結果如表4所示,6種鏈格孢霉毒素的回收率在82.5%～110.6%之間,相對標準偏差小于10%。研究表明,本方法對芒果中不同濃度的6種鏈格孢霉毒素的測定均有較高的回收率和精密度,符合檢測要求。

表4 芒果中6種鏈格孢霉毒素的添加回收率和精密度

2.4.3 實際樣品測定 隨機選取8個霉變和12個未霉變的芒果樣品,采用本方法對芒果樣品進行檢測。結果如表5所示,12個未霉變的芒果樣品中均未檢出6種鏈格孢霉毒素;8個霉變的芒果樣品中ALT均未檢出。而TeA、AME、AOH、Ten測定值分別在35.61～88.40、5.46～9.62、7.23～22.46、2.68～6.89 μg/kg范圍內(nèi)。有兩份芒果樣品檢測出ATS,分別為9.23和14.29 μg/kg。

表5 霉變芒果樣品中6種鏈格孢霉毒素的毒素含量

3 結論

本文采用5 mL 1.5%甲酸-乙腈溶液提取,2 g無水MgSO4除水,渦旋振蕩10 min,9500 r/min下離心5 min,離心后取全部上清液加入0.3 g NaCl鹽析,再次離心,最后提取上清液過膜的方法對加入3 mL水的5 g芒果樣品進行前處理,通過稀釋、小體積進樣來減小基質(zhì)效應,建立了芒果樣品中6種鏈格孢霉毒素QuEChERS前處理技術結合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的快速檢測方法。該方法操作簡便,高效靈敏,快速準確,滿足芒果中鏈格孢霉毒素的檢測要求,可用于實際樣品檢測。