裙帶菜α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的制備

李艷敏,郁書懷,仝艷軍,楊瑞金,趙 偉,,*

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

糖尿病是繼心血管病、腫瘤之后的第三大慢性非傳染性疾病[1]。其中,有超過90%的糖尿病患者患有2型糖尿病(T2DM)。2型糖尿病是一種由代謝、激素、表觀遺傳和氧化失衡等多因素引發(fā)的慢性疾病[2],可引發(fā)視網(wǎng)膜病變、腎病、缺血性心臟病和外周血管病變等多種并發(fā)癥[3]。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過阻斷碳水化合物在體內(nèi)的消化吸收防止餐后血糖升高,提高胰島素敏感性[4-5],被稱為糖尿病學“未被開發(fā)的鉆石”[6]。市面上常見的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物有阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等,雖藥效好,但是存在價格高、有副作用等缺點[7-9],因此,從天然產(chǎn)物中篩選和制備出安全、高效、低毒、價廉的α-葡萄糖苷酶抑制劑,成為2型糖尿病治療藥物的研究熱點。

目前,研究人員已從雞蛋蛋白[10]、鷹嘴豆[11]、牡丹籽[12]、蠶蛹[13]、條斑紫菜[14]等動植物蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化得到了一系列降血糖活性肽。裙帶菜(Undariapinnatifida)作為三大經(jīng)濟海藻之一,含有巖藻黃質(zhì)、多肽、褐藻多糖等降血糖成分[15],可在為身體提供營養(yǎng)的同時防控糖尿病。國內(nèi)對裙帶菜α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究還停留在極性提取上,黃曉冬等[16]發(fā)現(xiàn)裙帶菜的乙醇洗脫組分具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,馮學珍等[17]從裙帶菜的不同極性部位提取得到了α-葡萄糖苷酶抑制劑,但有關裙帶菜降血糖活性肽的研究尚未見報道。

我國裙帶菜的工業(yè)利用率僅達30%左右[18],嚴重導致了資源浪費及環(huán)境污染[19],開發(fā)裙帶菜α-葡萄糖苷酶抑制劑對于裙帶菜資源的充分開發(fā)利用及提高裙帶菜產(chǎn)業(yè)的附加值具有深遠的意義。本文以制備裙帶菜α-葡萄糖苷酶抑制活性肽入手,圍繞裙帶菜α-葡萄糖苷酶抑制劑的工藝優(yōu)化和理化性質(zhì)進行研究,為開發(fā)新型降血糖活性肽提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裙帶菜粉 江蘇華碩士食品有限公司;α-葡萄糖苷酶 上海源葉生物科技有限公司;堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶 諾維信生物技術有限公司;4-硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷 阿拉丁試劑有限公司;其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

MP-501A超級恒溫循環(huán)槽 上海一恒科技有限公司;C-MAG HS 4 S25磁力攪拌器、Genius3漩渦振蕩器 德國IKA公司;Five Easy Plus pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;T-6型紫外可見分光光度計 南京菲勒儀器有限公司;酶標儀 南京拜爾沃克智能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 裙帶菜的預處理 將裙帶菜粉過80目篩,置于50 ℃烘箱中烘干至恒重。在酶解前對裙帶菜進行沸水處理15 min,使酶解位點暴露[14]。

1.2.2 裙帶菜蛋白水解度測定 采用鄰苯二甲醛(OPA)法[20]。

1.2.3α-葡萄糖苷酶抑制率的測定 參考Kwon等[21]的方法,根據(jù)實際情況進行一定的修改。用67 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)把α-葡萄糖苷酶配制成0.5 U/mL的溶液。移取100 μLα-葡萄糖苷酶溶液和50 μL裙帶菜酶解液于96孔板中,充分混合,在37 ℃烘箱中孵育10 min,再加入50 μL 5 mmol/L的PNPG溶液,37 ℃反應0.5 h后加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液100 μL終止反應,于405 nm下測定吸光度,三次平行試驗取平均值。同時設立空白組和背景對照組。

式中:A1:空白組,以緩沖液代替裙帶菜酶解液反應后的吸光度;A2:樣品組,加入樣品反應后的吸光度;A3:背景對照組,以緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液反應后的吸光度。

1.2.4 蛋白酶的選擇 根據(jù)各蛋白酶的作用范圍,選擇合適的酶解條件,如表1所示。將50 mL裙帶菜溶液置于100 mL酶反應器中,用0.1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至酶的最適pH,在50 ℃下預熱30 min,加入蛋白酶酶解。反應結束后于沸水浴滅酶15 min,待冷卻后離心收集上清液。以抑制率為主要指標,蛋白質(zhì)水解度為輔助指標,篩選出最佳水解用酶。

表1 蛋白酶的作用條件

1.2.5 酶解條件單因素實驗 分別研究底物濃度、加酶量、pH、酶解溫度、反應時間對α-葡萄糖苷酶的抑制率和裙帶菜蛋白的水解度的影響。

1.2.5.1 底物濃度的確定 選取堿性蛋白酶,在加酶量8000 U/g、pH10.5、酶解時間4 h、酶解溫度50 ℃的條件下,考察1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%不同底物濃度對α-葡萄糖苷酶的抑制率和裙帶菜蛋白水解度的影響。

1.2.5.2 加酶量的確定 選取堿性蛋白酶,在底物濃度7%、pH10.5、酶解時間4 h、酶解溫度50 ℃的條件下,考察不同加酶量2000、4000、6000、8000、10000、12000 U/g對α-葡萄糖苷酶的抑制率和裙帶菜蛋白水解度的影響。

1.2.5.3 pH的確定 選取堿性蛋白酶,在底物濃度7%、加酶量10000 U/g、酶解時間4 h、酶解溫度50 ℃的條件下,考察不同pH8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0對α-葡萄糖苷酶的抑制率和裙帶菜蛋白水解度的影響。

1.2.5.4 酶解溫度的確定 選取堿性蛋白酶,在底物濃度7%、加酶量10000 U/g、pH10.0、酶解時間4 h的條件下,考察40、45、50、55、60 ℃不同酶解溫度對α-葡萄糖苷酶的抑制率和裙帶菜蛋白水解度的影響。

1.2.5.5 反應時間的確定 選取堿性蛋白酶,在底物濃度7%、加酶量10000 U/g、pH10.0、酶解溫度45 ℃的條件下,考察1、2、3、4、5 h不同反應時間對α-葡萄糖苷酶的抑制率和裙帶菜蛋白水解度的影響。

1.2.6 響應面優(yōu)化試驗 單因素實驗反映了底物濃度、pH、酶解溫度為影響抑制率較為顯著的三個因素,且酶解液的抑制率與水解度無線性關系。因此,運用Box-Behnken設計原理,控制加酶量10000 U/g,酶解時間1 h,以底物濃度(X1)、pH(X2)、酶解溫度(X3)為變量,以抑制率(Y)為響應值,展開三因素三水平的響應面試驗,因素與水平設計見表2。

表2 試驗設計因素與水平

1.2.7 裙帶菜降血糖活性肽的相對分子量分布 裙帶菜酶解液用0.22 μm濾膜處理備用。色譜條件:液相色譜柱TSKgel 2000 SWxl(300 mm×7.8 mm,5 μm);柱溫為30 ℃;流動相:水∶三氯乙酸∶乙腈=550∶450∶1 (V/V);流速為1 mL/min;進樣量為5 μL;檢測波長為220 nm。分子質(zhì)量校正曲線所用標準品:細胞色素(Mw=12500),桿菌酶(Mw=1450),乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(Mw=451),乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(Mw=189)[22]。

1.2.8 半抑制濃度和抑制類型的測定 半抑制濃度:將酶解液冷凍干燥。配制一系列不同濃度的多肽溶液(10、20、30、40、50、60 mg/mL),測定各濃度溶液的抑制率。

抑制類型:將裙帶菜多肽粉配制成30 mg/mL的溶液,固定多肽溶液和底物PNPG溶液的濃度不變,配制一系列不同濃度的α-葡萄糖苷酶溶液(1、0.5、0.333、0.25、0.167 U/mL),測定反應初速度。用緩沖溶液代替抑制劑作為空白對照。反應初速度以每分鐘生成的PNP量計算。以酶濃度為縱坐標、反應初速度為縱坐標做曲線。

將裙帶菜多肽粉配制成30 mg/mL的溶液,固定多肽溶液和酶溶液的濃度不變,配制一系列不同濃度的PNPG溶液(2、4、6、8、10 mmol/L),測定反應初速度。用緩沖溶液代替抑制劑作為空白對照。以PNPG濃度為縱坐標、反應初速度為縱坐標做曲線。然后以PNPG濃度的倒數(shù)為橫坐標、以反應初速度的倒數(shù)為縱坐標,作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,判斷裙帶菜酶解液的抑制類型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗部分數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。使用Origin 9.1作圖,SPSS 24和Excel 2017數(shù)據(jù)分析,響應面實驗采用Design-Expert.V8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)處理及相關分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

各類蛋白酶的主要作用位點如表3所示,酶切位點不同導致產(chǎn)生不同大小和結構的多肽,具有不同的生理活性[14]。如圖1所示,裙帶菜經(jīng)5種不同蛋白酶水解后,抑制作用最強的是堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物,抑制率達到23.63%,其次是木瓜蛋白酶,且經(jīng)堿性蛋白酶酶解的酶解液的水解度僅次于風味蛋白酶。據(jù)報道,活性肽段通過氫鍵、極性和疏水作用與α-葡萄糖苷酶催化位點上的氨基酸相結合,從而阻礙糖苷酶的生理功能[5],多肽C端存在丙氨酸、蛋氨酸殘基和N端存在含羥基的氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)殘基可能會增強抑制活性[23]。鑒于堿性蛋白酶存在丙氨酸和酪氨酸的酶切位點,其酶解產(chǎn)物擁有的特定序列可能通過某種作用與α-葡萄糖苷酶催化位點上的氨基酸相結合,且結合程度相比于其他蛋白酶酶解產(chǎn)物更高,由此得到了最大抑制率。綜上,選取堿性蛋白酶作為最佳用酶,進行接下來的工藝優(yōu)化。

表3 各類蛋白酶的主要作用位點

圖1 最佳蛋白酶的選擇

2.2 單因素酶解條件的研究

2.2.1 底物濃度的確定 從圖2可以看出,隨著底物濃度不斷升高,酶解液的抑制率和蛋白質(zhì)水解度都在初期呈現(xiàn)上升趨勢,底物濃度7%時抑制率最高,為42.87%,此時的水解度為16.66%,但底物濃度5%～8%之間的抑制率無顯著性差異(P>0.05)。出現(xiàn)此現(xiàn)象的可能原因是隨著底物濃度的增高,溶液黏度不斷增加,阻礙了酶與底物的充分接觸,致使水解度和抑制率降低。因此,將底物濃度7%作為響應面中心實驗點。

圖2 不同底物濃度對抑制率和水解度的影響

2.2.2 加酶量的確定 由圖3可知,隨著加酶量的增加,酶解液的抑制率和蛋白質(zhì)水解度都在初期呈現(xiàn)上升趨勢,當加酶量為10000 U/g時,抑制率達到最大值為44.69%,隨后抑制率開始顯著下降(P<0.05),但是水解度仍然顯著升高(P<0.05),當加酶量為12000 U/g時,水解度達到最高?？赡苡捎谠?0000 U/g的加酶量時水解過度,導致抑制率下降。因此,選擇最佳加酶量為10000 U/g。

圖3 不同加酶量對抑制率和水解度的影響

2.2.3 pH的確定 pH的大小影響酶的構象和穩(wěn)定性,還影響酶和底物的解離狀態(tài),進而影響其催化活性。因此,在一定條件下酶都有最適的pH。由圖4可以看出,隨著pH的增加,在一定范圍內(nèi),酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制率呈現(xiàn)上升趨勢,當pH為10.0時,抑制率達到最大值為46.18%,隨后抑制率開始下降,但pH9.0～10.5之間抑制率不存在顯著性差異(P>0.05)。pH9.5之后水解度隨著pH的增加而顯著下降(P<0.05)?？赡苡捎趬A性蛋白酶的最適pH在9.5及之前,這與周鋒[14]在探究堿性蛋白酶酶解條斑紫菜蛋白制備降血糖活性肽的結果是一致的。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是,在pH在9.0～10.5范圍時,堿性蛋白酶不是處在最適pH,水解度沒有達到最大,但酶解產(chǎn)生的多肽分子量大小恰好可與α-葡萄糖苷酶作用,產(chǎn)生最大抑制。因此,將pH10.0作為響應面中心試驗點。

圖4 不同pH對抑制率和水解度的影響

2.2.4 酶解溫度的確定 由圖5可以看出,抑制率隨反應溫度變化的趨勢與pH類似,當溫度為45 ℃時,抑制率達到最大值為50.32%,50 ℃以后抑制率開始顯著下降(P<0.05),但45與50 ℃之間抑制率不存在顯著性差異(P>0.05)。水解度隨著pH的增加也呈現(xiàn)相似趨勢,在溫度為55 ℃時水解度最大。說明在此反應中堿性蛋白酶的最適溫度是55 ℃附近。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是,在45～50 ℃時,堿性蛋白酶不是處在最適溫度,水解度沒有達到最大,但酶解產(chǎn)生的多肽分子可與α-葡萄糖苷酶更好結合,產(chǎn)生最大抑制,當溫度繼續(xù)升高,水解度不斷增加,水解產(chǎn)生的多肽過小,溶液中有效活性肽段的比例降低,抑制率下降。因此,將溫度45 ℃作為響應面中心試驗點。

圖5 不同溫度對抑制率和水解度的影響

2.2.5 反應時間的確定 由圖6可以看出,酶解液對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著反應時間的增加沒有顯著性變化(P>0.05)。水解度隨著反應時間的增加先升高后降低,在反應時間為4 h時水解度最大。但是,兩個指標的變化幅度都不大,可能是因為在加酶量較大的情況下,酶解反應迅速進行,在1 h左右反應就已經(jīng)基本進行完成,在之后的幾小時不會產(chǎn)生較大的變化。因此,為了提高實驗效率,選擇最佳反應時間為1 h。

圖6 不同反應時間對抑制率和水解度的影響

2.3.1 響應面優(yōu)化試驗設計及結果 17個試驗點的試驗結果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果

2.3.2 模型方差分析 對表4的試驗數(shù)據(jù)進行分析,得到回歸方程:

各因素對抑制率影響的方差分析如表5所示。

表5 回歸模型的方差分析

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.3 各因素交互作用分析 曲面的陡峭程度可說明因素對抑制率的影響大小,等高線形狀可判斷各因素交互作用的強弱[24]。圖7a的等高線圖形狀近似圓形,表明底物濃度與pH兩個自變量之間的交互作用不顯著,底物濃度對抑制率的影響較大,表現(xiàn)為響應面圖曲線較陡峭和等高線較密集。圖7b的等高線形狀呈橢圓形,表明底物濃度與溫度的交互作用顯著,底物濃度對抑制率的影響大于溫度。圖7c的等高線形狀呈橢圓形,表明溫度與pH的交互作用顯著,pH對抑制率的影響遠大于溫度,在一定程度上增大pH有助于得到更高的抑制率。這與表5的方差分析結果一致。

圖7 各因素交互水平對抑制率影響的響應面和等高線圖

2.3.4 驗證實驗 采用Design-Expert 8.0.6.1對回歸模型進行分析,得到最佳工藝為:底物濃度7.11%,pH10.14,溫度47.48 ℃,加酶量10000 U/g,反應時間1 h,活性肽抑制率的最大預測值為51.31%。因儀器設定條件及實驗操作方便等原因?qū)l件相應調(diào)整為底物濃度7.11%,pH10.14,溫度47 ℃,加酶量10000 U/g,反應時間1 h。開展三次平行試驗進行驗證,酶解液的抑制率為51.17%,此結果與最佳酶解條件下的預測值的誤差小于1%,說明回歸方程與實際情況擬合良好,可以應用于實際操作。

2.4 裙帶菜降血糖活性肽的分子量分布

研究表明,肽的生物活性與其分子量大小有著緊密聯(lián)系。2～4個氨基酸組成的小肽具有特殊的轉(zhuǎn)運機制,吸收速度快且不消耗能量。短肽容易以完整的形式被吸收進入人體代謝循環(huán)中,從而其生理活性較易保持。顧欣等[25]在研究山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽時發(fā)現(xiàn),酶解肽的分子量越小,對α-葡萄糖苷酶的抑制率越大。因此,本研究采用液相色譜柱TSKgel 2000 SWxl對裙帶菜酶解液的相對分子質(zhì)量分布進行分析,繪制圖8所示的分子量分布矯正曲線,得到表6所示的分子量分布。

圖8 分子量分布矯正曲線

表6 裙帶菜酶解液的分子量分布

由表6可以看出,裙帶菜粉經(jīng)堿性蛋白酶酶解1 h后所得的酶解液中,分子量在5 kDa以上的肽段已經(jīng)很少,分子量在1 kDa以下的小分子多肽所占的比例極大,其中有73.90%比例的多肽分子量小于0.5 kDa,即二肽、三肽、四肽或氨基酸,這部分肽段可能對抑制α-葡萄糖苷酶有著主要貢獻,且較易被人體吸收利用。

2.5 半抑制濃度和抑制類型

2.5.1 半抑制濃度 由圖9可以看出,隨著裙帶菜酶解液濃度的升高,抑制率逐漸升高,但是濃度與抑制率并不是線性關系。當濃度為46.097 mg/mL時,抑制率達到50%,此濃度為裙帶菜降血糖活性肽的半抑制濃度。與陽性對照阿卡波糖(0.119 mg/mL)相比,樣品的抑制作用較弱,原因是裙帶菜活性肽的純度較低,仍含有許多雜質(zhì),可通過進一步的純化提高抑制能力。

圖9 裙帶菜降血糖活性肽和阿卡波糖的IC50測定

2.5.2 抑制類型 由加抑制劑與不加抑制劑的酶反應速率曲線可判斷出抑制作用是否可逆,兩條曲線平行則為不可逆抑制,兩條曲線相交于原點則為可逆抑制[26]。由圖10可知,兩條圖線近似交于原點,且隨著抑制劑的加入,圖線斜率下降,表明裙帶菜降血糖活性肽的抑制作用是一個可逆過程,抑制劑通過非共價鍵與酶或酶-底物復合物可逆性結合,降低酶的催化活性進而降低反應速率[27]。

圖10 裙帶菜降血糖活性肽對α-葡萄糖苷酶抑制作用分析

由圖11可知,隨著底物濃度的增加,酶反應速度都有所增加,加入抑制劑的實驗組相較于不加抑制劑的實驗組,速率增加更加緩慢。以PNPG濃度的倒數(shù)為橫坐標、以反應初速度的倒數(shù)為縱坐標,作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,如圖12所示。

圖11 α-葡萄糖苷酶的v-[S]圖

圖12 α-葡萄糖苷酶的雙倒數(shù)曲線

Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖是一種判斷酶抑制類型非常有效的方法,作圖后如果得到一組相較于Y軸的直線,則為競爭性抑制,如果得到一組相交于X軸的直線,則為非競爭性抑制,如果得到一組平行的直線,則為反競爭性抑制,如果得到一組交于二、三象限的直線,則為混合型抑制[28]。由圖12可以看出,兩條圖線交于第二象限,說明加入抑制劑后,米氏常數(shù)Km增大,最大反應初速度Vm減小,因此本抑制類型為典型的混合型抑制。抑制劑既能在酶的活性部位以外與游離酶結合,也能在非活性中心位點與酶-底物絡合物結合,致使反應速率的降低[29]。

3 結論

隨著糖尿病患者急劇增多,尋找安全有效的降血糖藥物成為亟待解決的一大問題,利用現(xiàn)代生物技術開發(fā)裙帶菜相關保健食品,可以改善膳食營養(yǎng)結構,提高人類健康水平,滿足藥食同源的需求。本研究利用堿性蛋白酶酶解裙帶菜制備降血糖活性肽,經(jīng)過單因素實驗和響應面優(yōu)化試驗,得到最佳酶解工藝為底物濃度7.11%,pH10.14,溫度47 ℃,加酶量10000 U/g,反應時間1 h,在此條件下得到酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制率為51.17%,酶解產(chǎn)物主要為較易被人體吸收利用的短肽類,半抑制濃度為46.097 mg/mL,抑制類型為典型的可逆混合型抑制。研究內(nèi)容對于尋找新型α-葡萄糖苷酶抑制劑和發(fā)展裙帶菜的深加工產(chǎn)業(yè)具有一定的借鑒意義,但是還存在著酶解產(chǎn)物純度低、只進行了體外實驗等問題,未來需要對活性肽進一步純化并開展體內(nèi)研究,發(fā)現(xiàn)其抑制α-葡萄糖苷酶的分子機制,并探索實驗室研究成果與產(chǎn)業(yè)相連接的有效方法。