豆豉中丁硫克百威降解菌的篩選及鑒定

郭薇丹,肖 毓,林 欣,羅 煜,付湘晉

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410004)

丁硫克百威(carbosulfan)是一種氨基甲酸酯類殺蟲劑,在水果、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物中有著較為廣泛的應(yīng)用[1],其本身是克百威的低毒化衍生物,化學(xué)名稱為2,3-二氫-2,2-二甲基苯并呋喃-7-基(二丁基氨基硫)N-甲基氨基甲酸酯,分子式為C20H32N2O3S，純品是褐色粘稠液體,能和二甲苯、丙酮、乙醇互溶,是一種高效廣譜的氨基甲酸酯類的殺蟲劑[2],丁硫克百威對(duì)昆蟲具有胃毒和觸殺作用[3]。其殺滅蟲害的機(jī)理主要抑制乙酰膽堿酯酶的活性[4]。其特點(diǎn)是脂溶性強(qiáng)、作用迅速、滲透力強(qiáng)、有較強(qiáng)的殘效等[5]。主要用來防治柑橘等水果及棉花、蔬菜、水稻、玉米、甘蔗等多種經(jīng)濟(jì)作物上的蟲害,對(duì)蚜蟲的防治效果尤為突出[6]。

丁硫克百威殘留屬于較突出的非持久性農(nóng)藥污染問題之一,在被重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的10余種禁用農(nóng)藥中[7],克百威殘留超標(biāo)率最為嚴(yán)重,在土壤[8]、糧食作物、果蔬、食用菌、茶葉等中均有檢出丁硫克百威殘留[9],檢出率范圍為0.96%～56.3%,超標(biāo)率范圍為0.0017%～20.9%[10],是水胺硫磷超標(biāo)率的2倍,甲基異硫磷超標(biāo)率的8倍[11]。

農(nóng)藥降解菌的篩選是當(dāng)前農(nóng)藥降解研究的熱點(diǎn)[12]。劉新等[13]從土壤中分離了一株可降解毒死蜱的曲霉和一株既可以降解毒死蜱同時(shí)也能降解甲胺磷的木霉。劉智等[14]對(duì)甲基對(duì)硫磷降解菌DLL-1進(jìn)行誘變育種后得到了4株降解譜較寬的菌株,分別對(duì)辛硫磷、馬拉硫磷、鄰氨基酚等有不同程度的降解。Rousseaux等[15]從受污染較嚴(yán)重的土壤中篩選得到25株能對(duì)阿特拉津產(chǎn)生降解效應(yīng)的微生物。鄭柳柳等[16]從生產(chǎn)工廠的排污口中篩選出13株細(xì)菌,其中一株假單胞菌AD1能在72 h內(nèi)將濃度為0.3 g/L的阿特拉津幾乎完全降解。遲濤等[17]對(duì)低溫發(fā)酵條件下的乳酸菌對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解作用進(jìn)行了研究,所選3株植物乳桿菌對(duì)樂果、久效磷均有降解促進(jìn)的作用。陳芳芳[18]對(duì)發(fā)酵食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)乳酸菌及霉菌對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的降解有促進(jìn)作用。周欣偉[19]通過研究發(fā)酵食品中有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物降解,發(fā)現(xiàn)乳酸菌中磷酸酯酶的活性與有機(jī)磷農(nóng)藥的降解促進(jìn)作用成正比,微生物的發(fā)酵過程可以大大提高有機(jī)磷農(nóng)藥的降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)。王晶等[20]研究了3株乳酸菌對(duì)7種有機(jī)磷農(nóng)藥的降解作用,發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌1.0343降解作用較強(qiáng),3株乳酸菌對(duì)馬拉硫磷、倍硫磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷的降解作用整體較強(qiáng),而對(duì)敵百蟲、久效磷、樂果的作用整體較弱。趙靜等[21]從石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站采集土樣15份,采用富集培養(yǎng)的方法篩選到1株丁硫克百威降解菌,鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。王新等[22]從原沈陽(yáng)東北制藥廠區(qū)污染土壤中分離出4株對(duì)克百威、毒死蜱具有一定的降解能力的優(yōu)勢(shì)菌種,為蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscircus)。余磊等[23]從楊凌某農(nóng)藥廠排污口處的污泥中分離得到1株能有效降解克百威的細(xì)菌,鑒定為假單胞菌屬。喬潤(rùn)香等[24]從廣東、安徽、貴州、山東、山西、河北、遼寧等地采集土樣中篩選得到克百威降解菌株,鑒定為酵母菌[25]。

上述文獻(xiàn)表明,目前,丁硫克百威的降解菌主要從土壤中篩選,均不能用于食品中降解丁硫克百威;如果以傳統(tǒng)發(fā)酵食品為分離材料,則更有可能篩選到可應(yīng)用于食品的降解菌。本研究以豆豉為分離材料,經(jīng)過馴化富集、平板劃線獲得單菌落,采用高效液相色譜法測(cè)定降解菌株對(duì)丁硫克百威的降解率,篩選降解率高的菌株;并分析這些降解菌株對(duì)丁硫克百威降解特性,為開發(fā)新型微生物農(nóng)藥降解劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

老一品香瀏陽(yáng)豆豉 從超市中購(gòu)得;PDA培養(yǎng)基、MHA培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;丁硫克百威(>98%標(biāo)準(zhǔn)品),3羥基-丁硫克百威(>98%標(biāo)準(zhǔn)品) 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司;其他試劑 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LC-20A高效液相色譜儀 配備紫外檢測(cè)器和LCsolition工作站,日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 無機(jī)鹽培養(yǎng)基:NaCl 0.5 g,NH4NO31.0 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,K2HPO41.5 g,(NH4)2SO40.5 g,超純水1 L,調(diào)節(jié)pH至7.0。

富集培養(yǎng)基:NaCl 1.0 g,KH2PO41.0 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖1.0 g,超純水1 L,調(diào)節(jié)pH至7.0。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,牛肉膏3.0 g,蒸餾水 1000 mL,瓊脂18.0 g,調(diào)節(jié)pH至7.0。

LB液體培養(yǎng)基:NaCl 10.0 g,酵母浸粉 5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,超純水1 L,調(diào)節(jié)pH至7.0[22]。

菌株富集培養(yǎng)及菌株降解丁硫克百威實(shí)驗(yàn)中,需要在培養(yǎng)基中添加丁硫克百威,添加方法是,培養(yǎng)基滅菌、冷卻后在無菌條件下將丁硫克百威加入培養(yǎng)基中。

1.2.2 HPLC法測(cè)定丁硫克百威 根據(jù)國(guó)標(biāo)(GB 23200.112-2018)進(jìn)行測(cè)定[26]。將老一品香瀏陽(yáng)豆豉研磨后,以二氯甲烷作為提取溶劑提取丁硫克百威[15],采用搖床振蕩方式常溫提取丁硫克百威10 min。

色譜條件:色譜柱為ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),選擇檢測(cè)條件為柱溫30 ℃,流動(dòng)相為水∶甲醇(10∶90,V/V),流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,進(jìn)樣量20 μL[27]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間定性,外標(biāo)法峰面積定量。將丁硫克百威系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測(cè)定響應(yīng)的峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用峰面積及質(zhì)量濃度得出丁硫克百威的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=37794X+12151,R2=0.9999。方法檢出限0.01 mg/L,定量限0.10 mg/L,回收率在91.51%～97.7%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.22%～2.26%,符合國(guó)家NY/T 788-2018農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則中要求。

1.2.3 降解菌篩選

1.2.3.1 丁硫克百威降解菌株的富集 分別稱取豆豉20 g放入裝有180 mL富集培養(yǎng)基(丁硫克百威100 mg/L)的三角瓶中,將三角瓶中,置于35 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)7 d。然后以10%的接種量轉(zhuǎn)接到丁硫克百威終濃度為200 mg/L的新鮮的富集培養(yǎng)液中,繼續(xù)培養(yǎng)7 d,此后依次逐漸增加富集培養(yǎng)基中丁硫克百威濃度,每次增加量為100 mg/L,直到最后富集培養(yǎng)基中的丁硫克百威濃度達(dá)到500 mg/L,最后將獲得的富集培養(yǎng)液用于菌株分離[28]。

1.2.3.2 丁硫克百威降解菌株的分離 采用10倍稀釋涂布法稀釋最終取得的馴化液,在無機(jī)鹽培養(yǎng)基固體平板上(添加丁硫克百威終濃度為500 mg/L)進(jìn)行涂布,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d,選擇在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速、菌落規(guī)則的單菌落劃線于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基以及PDA培養(yǎng)基上,對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行單菌落分離后轉(zhuǎn)接至試管中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 菌株對(duì)丁硫克百威的降解 將分離純化后獲得的菌株接種于裝有50 mL的LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,在30 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床中10 °傾斜振蕩培養(yǎng)24 h,將此菌液作為菌株的擴(kuò)增液。取擴(kuò)增液在冷凍高速離心機(jī)中以4 ℃、10000 r/min條件下離心10 min,倒掉上清液,用滅菌的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基沖洗沉淀,離心沖洗3次。最后用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,使菌體濃度達(dá)到107CFU/mL,作為種子液備用。取5 mL種子液與50 mL丁硫克百威濃度為500 mg/L的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基混合,以不接菌為對(duì)照,30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3、5、7 d,測(cè)定丁硫克百威的含量,篩選丁硫克百威降解量高于60%的菌株作為試驗(yàn)菌株,并編號(hào)保存。

1.2.4 丁硫克百威降解菌株的鑒定 將篩選出的細(xì)菌采用通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用TSINGKE DNA凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)切膠回收目的片段以相應(yīng)引物測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。通過GenBank下載相關(guān)菌株的rDNA序列,與測(cè)定的菌株序列儀器進(jìn)行多重序列比對(duì),利用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 降解菌對(duì)丁硫克百威產(chǎn)物克百威、3-羥基丁硫克百威的降解活性 因?yàn)槎×蚩税偻谒嵝原h(huán)境中易水解成克百威及3-羥基丁硫克百威,在無機(jī)鹽培養(yǎng)基溶液中加入丁硫克百威至100 mg/L,調(diào)節(jié)溶液pH至3.0,將無機(jī)鹽培養(yǎng)基溶液置入恒溫?fù)u床,待測(cè)得丁硫克百威濃度低于HPLC法檢測(cè)限后(<0.01 mg/L),將pH調(diào)節(jié)至7.0,按照1.2.3.3操作加入降解菌株,對(duì)照組加入相同體積的無菌水,30 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d,采用HPLC法測(cè)定克百威以及3-羥基丁硫克百威[15]。

1.2.6 pH對(duì)降解菌降解丁硫克百威的影響 由于丁硫克百威在pH低于3的環(huán)境下極易水解,不具有參考價(jià)值,因此配制pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,以不加菌作為對(duì)照組,30 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d,測(cè)定丁硫克百威降解率。

1.2.7 溫度對(duì)降解菌降解丁硫克百威的影響 在pH=7條件下,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,分別在4、10、20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)3 d,以不加菌作為對(duì)照組,測(cè)定丁硫克百威降解率。

1.2.8 降解菌降解丁硫克百威動(dòng)力學(xué)特性 將高降解菌株,按照1.2.3.3操作,接入高降解率菌株,在30 ℃、pH=7的條件下放置在恒溫氣浴搖床進(jìn)行處理。分別在1、2、3、4、5、6、7、8、9 d時(shí)取樣進(jìn)行降解率的測(cè)定,進(jìn)而分析4株菌株的降解動(dòng)力學(xué),每組設(shè)置3個(gè)平行,同時(shí)設(shè)置不加菌作為對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.2.9 丁硫克百威降解率的計(jì)算

降解率(%)=C1×100/C0

式中,C1:降解后培養(yǎng)液中丁硫克百威濃度(mg/L);C0:培養(yǎng)液中初始丁硫克百威濃度(mg/L)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、圖形擬合、繪圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過SPSS Statistics軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)。使用GraphPad Prism 7進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌對(duì)丁硫克百威的降解效率

通過對(duì)分離材料進(jìn)行培養(yǎng)富集后。對(duì)所得菌液進(jìn)行涂布平板法和平板劃線法,分離、純化,從而得到純菌落。最終得到14 株降解菌,標(biāo)記為JJ-1～JJ-14。14種菌株在3、5、7 d時(shí)對(duì)丁硫克百威的降解率如表1所示。

表1 降解菌株對(duì)丁硫克百威的降解率

根據(jù)表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,其中4株菌株JJ-1、JJ-4、JJ-5以及JJ-8的降解率優(yōu)于趙靜等[21]在土壤中所篩選出的降解菌的降解率(63.98%),以及王新等[22]從污染土壤中分離出的降解菌的降解率(60%)。因此選擇JJ-1、JJ-4、JJ-5以及JJ-8進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 丁硫克百威降解菌株的鑒定

對(duì)篩選所得的14 株中降解率較高的4株菌株進(jìn)行測(cè)序鑒定,初步鑒定菌株JJ-1為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、JJ-4為畢赤酵母(Pichiapastoris)、JJ-5為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、JJ-8為柑桔青霉(Penicilliumcitrinum)。畢赤酵母是許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的常見菌株,也已經(jīng)用于飼料發(fā)酵,安全性較高[29]。

圖1 菌株JJ-1、JJ-4、JJ-5及JJ-8的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 降解菌對(duì)丁硫克百威水解產(chǎn)物的影響

降解菌對(duì)克百威及3-羥基克百威的降解效果如圖2所示。通過比較對(duì)照組數(shù)據(jù)可以得出四株菌株均對(duì)克百威有降解效果(降解率51.39%～57.14%,無顯著差異),但只有菌株JJ-4對(duì)克百威及3-羥基克百威有較好的降解效果,JJ-4在3 d時(shí)對(duì)3-羥基克百威降解率達(dá)到73.24%。

圖2 降解菌對(duì)丁硫克百威水解產(chǎn)物的影響

2.4 pH對(duì)降解菌降解丁硫克百威的影響

通過圖3可以發(fā)現(xiàn)丁硫克百威自身水解速率隨pH的降低而加快,而在pH偏中性或堿性環(huán)境下,丁硫克百威比較穩(wěn)定,pH對(duì)水解效果的影響與羅俊凱等[30]的研究相同。在pH偏堿性時(shí),菌株JJ-1以及JJ-5不能表現(xiàn)出很好的降解活性。同時(shí)可以看出菌株JJ-4在pH5～9的范圍內(nèi)均有較好的降解效果。

圖3 pH對(duì)降解率的影響

2.5 溫度對(duì)降解菌降解丁硫克百威的影響

由圖4可知,丁硫克百威自身的水解速率隨溫度的升高而加快,在高溫環(huán)境下丁硫克百威容易進(jìn)行水解,溫度對(duì)水解效果的影響與羅俊凱等[30]的研究相同。在低溫環(huán)境下時(shí)(4 ℃),菌株JJ-1對(duì)丁硫克百威有15%左右的降解,其它3個(gè)菌株均不能表現(xiàn)出很好的降解效果,這是由于低溫環(huán)境影響了降解菌的生物活性。而在40 ℃時(shí),菌株JJ-4、JJ-8表現(xiàn)出了超出丁硫克百威自身水解的降解效果?？鄢×蚩税偻陨硭?JJ-1、JJ-5、JJ-8菌株在30 ℃左右時(shí)表現(xiàn)出最高降解效率,菌株JJ-4的降解效率在35 ℃左右最高,達(dá)72.96%,超出丁硫克百威自身降解率(41.68%)。

圖4 溫度對(duì)降解率的影響

2.6 降解菌降解丁硫克百威的動(dòng)力學(xué)特性

通過計(jì)算9 d的降解率得出4種菌株的降解率曲線,如圖5所示,動(dòng)力學(xué)擬合方程見表2。

表2 降解菌株對(duì)丁硫克百威的降解動(dòng)力學(xué)方程式及其參數(shù)

圖5 降解菌株對(duì)丁硫克百威的降解率曲線

在pH=7,30 ℃條件下,丁硫克百威的自然降解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=10.872e0.1692d,相關(guān)系數(shù)r=0.9980,水解速率常數(shù)為0.1692,水解半衰期9.01 d。在菌株JJ-1作用下丁硫克百威的半衰期在4.06 d,在菌株JJ-4作用下丁硫克百威的半衰期在3.20 d。

3 結(jié)論

獲得4株能夠高效降解丁硫克百威及其代謝產(chǎn)物的菌株,菌株JJ-1為為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida),JJ-4為畢赤酵母(Pichiapastoris),JJ-5為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens),JJ-8為柑桔青霉(Penicilliumcitrinum)。

4株降解菌株對(duì)克百威都有一定降解效果,JJ-4對(duì)3-羥基克百威也有較好的降解效果,3 d時(shí)的降解率達(dá)73.24%。

菌株JJ-4在pH范圍5～9之間均表現(xiàn)出良好的降解效果,pH=8時(shí)對(duì)丁硫克百威降解率達(dá)到50.87%。35、40 ℃時(shí)JJ-4對(duì)丁硫克百威降解率超過78%,能很好的適應(yīng)高溫環(huán)境。

菌株對(duì)丁硫克百威的降解速率符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。菌株JJ-4降解丁硫克百威的動(dòng)力學(xué)方程是Ct=36.189e0.1009d(R2=0.9912),半衰期3.20 d。