白芷質(zhì)量分析及標(biāo)準(zhǔn)探索研究

李珍 孟美英 楊洋 張燁 呂彩蓮 丁華（鄂爾多斯市藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究中心鄂爾多斯017000）

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根,最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，臨床主要用于治療感冒頭痛、鼻塞、鼻淵、白帶等證，常用于多種中成藥組方[1]，也作為藥食同源藥材被百姓廣泛接受并普遍使用。白芷藥材主要含香豆素類化合物，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2015年版一部“白芷”項(xiàng)下的檢驗(yàn)方法專屬性較強(qiáng)，基本可以控制市場(chǎng)上白芷的質(zhì)量，但薄層鑒別和含量測(cè)定方法仍可提高完善。由于歐前胡素和異歐前胡素均為白芷的主要化學(xué)成分，但目前藥典“白芷”項(xiàng)下的含量測(cè)定指標(biāo)為歐前胡素，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)資料[2-7]對(duì)白芷中歐前胡素和異歐前胡素雖然有研究檢測(cè)，但多數(shù)沿用甲醇和水為流動(dòng)相且都缺少耐用性試驗(yàn)。本文在參考結(jié)合上述文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)過對(duì)多批次白芷的質(zhì)量分析研究，建立了歐前胡素含量快篩方法。在此基礎(chǔ)上，又增加了白芷另一指標(biāo)性成分異歐前胡素的含量測(cè)定方法，且采用HPLC法實(shí)現(xiàn)對(duì)白芷中歐前胡素和異歐前胡素兩種化學(xué)成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種成分達(dá)到了較好的分離效果，方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。此次檢驗(yàn)研究既對(duì)現(xiàn)行藥典白芷含量測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)，又有效控制了市場(chǎng)上白芷藥材的質(zhì)量。

1 質(zhì)量分析

本次抽取的49批白芷覆蓋了內(nèi)蒙古自治區(qū)12個(gè)盟市的51家醫(yī)療機(jī)構(gòu)和經(jīng)營(yíng)單位，由河北、內(nèi)蒙古、黑龍江等7個(gè)省的36家企業(yè)生產(chǎn)。全項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果合格率為93.9%，所有批次性狀、鑒別、水分、浸出物項(xiàng)符合藥典要求，主要不合格項(xiàng)目集中在含量測(cè)定與總灰分檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其理化鑒別與含量對(duì)應(yīng)，彼此驗(yàn)證，呈現(xiàn)正關(guān)聯(lián)。另外除水分、總灰分檢查項(xiàng)外，其余項(xiàng)目結(jié)果與外觀性狀并非理想的正態(tài)分布。這可能與藥材（飲片）的產(chǎn)地、來(lái)源、采收期、炮制工藝、貯存養(yǎng)護(hù)以及票據(jù)與樣品的匹配程度有一定的關(guān)系。

樣品中49%的白芷來(lái)源于河北省企業(yè)，同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)不同批次的該藥品、同一企業(yè)生產(chǎn)的同一批次樣品在不同銷售地域之間、同一個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的飲片在市、縣、鄉(xiāng)級(jí)各醫(yī)療單位與經(jīng)營(yíng)單位之間都存在質(zhì)量差別。

整體來(lái)看，市場(chǎng)上白芷栽培品種日益增多，從性狀上觀察有明顯變化，斷面顏色出現(xiàn)黃棕色。檢查項(xiàng)下水分、總灰分測(cè)得數(shù)據(jù)分布相對(duì)集中，總灰分有1批超出限度。浸出物結(jié)果數(shù)據(jù)較分散，從略高于標(biāo)準(zhǔn)的15.5%至高于標(biāo)準(zhǔn)4.8倍的73.3%，數(shù)值跨度很大。含量測(cè)定總體趨勢(shì)與浸出物相似,數(shù)據(jù)分布于0.050%～0.314%，2批次低于標(biāo)準(zhǔn)值，最高值為標(biāo)準(zhǔn)值的3.7倍，且與浸出物值非正相關(guān)。二氧化硫殘留量的測(cè)定結(jié)果為14批樣品有不同程度的二氧化硫殘留，最高值為50 mg·kg-1，但均符合藥典要求。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及綜合分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：性狀顏色與歐前胡素含量高低有關(guān)，橫切面顏色呈黃棕色明顯高于呈白色的白芷樣品；浸出物與含量不存在明顯的關(guān)聯(lián)；二氧化硫殘留量結(jié)果與樣品含量有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)二氧化硫熏蒸后樣品歐前胡素含量會(huì)降低，這與文獻(xiàn)[8]結(jié)論一致。

2 探索發(fā)現(xiàn)

大量的試驗(yàn)表明白芷歐前胡素含量測(cè)定項(xiàng)下：在白芷樣品主峰歐前胡素保留時(shí)間前10～20 min出現(xiàn)的肩峰與白芷藥材（飲片）品種及質(zhì)量等其他因素有關(guān)，此峰的高低、大小不同，白芷藥材（飲片）的外觀性狀、歐前胡素含量均有所差別。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只需通過所得白芷樣品液相圖譜大致出峰時(shí)間及峰形，無(wú)需計(jì)算即可判斷歐前胡素的含量范圍。含量值大于等于0.138%時(shí)，色譜圖中必然在主峰歐前胡素保留時(shí)間前10～20 min之間出現(xiàn)前低后高的肩峰且響應(yīng)值高；當(dāng)含量值小于0.110%時(shí)，色譜圖中不出現(xiàn)前低后高的肩峰；而含量在0.110%～0.138%之間則偶爾會(huì)出現(xiàn)該峰，即只要主峰歐前胡素保留時(shí)間前10～20 min之間出現(xiàn)前低后高的肩峰，含量測(cè)定項(xiàng)就符合現(xiàn)行藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。這樣借助液相色譜圖初判白芷含量大致范圍的方法，不但能檢查控制白芷的內(nèi)在質(zhì)量，還可實(shí)現(xiàn)部分企業(yè)方便快捷、節(jié)約成本、耗時(shí)少見效快的檢驗(yàn)?zāi)康?，故認(rèn)為可用于白芷含量的快速初篩。色譜圖見圖1，驗(yàn)證數(shù)據(jù)見表1。具體方法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為甲醇-水（45∶55）、乙腈-水（48∶52）、乙腈-0.1%的磷酸水溶液（48∶52）中的任一種，且流動(dòng)相比例可上下浮動(dòng)5%；檢測(cè)波長(zhǎng)為300±2 nm、249±2 nm中的任一種，分離度不低于1.5，理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)算，應(yīng)不低于5000。

對(duì)照品溶液的制備：取歐前胡素對(duì)照品或含歐前胡素對(duì)照品的混合對(duì)照適量，加甲醇或乙醇配制成一定濃度的對(duì)照品溶液，濃度為 1.2～19.3 μg·min-1時(shí)最佳。

樣品溶液的制備：稱取一定量的白芷樣品，取樣量為0.1～5.0 g最佳，加一定量甲醇或不同濃度的乙醇超聲或回流提取，提取溶劑用量以5～100 mL，時(shí)間為30～60 min時(shí)最佳。取出，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

分別精密吸取對(duì)照溶液與供試品溶液各5～20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，觀察色譜圖。

表1 快篩結(jié)果規(guī)律驗(yàn)證表Tab1 The verification table of rapid screening

3 含量測(cè)定研究

3.1 儀器與試劑試藥：AL204-IC型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；PB211D型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；KQ-5200DE型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；U3000型高效液相色譜儀，包括紫外檢測(cè)器（賽默飛世爾科技有限公司）；1260型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）。歐前胡素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110826-201618，純度99.6%）和異歐前胡素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110827-201611，純度99.4%）。乙腈為色譜純，其他均為分析純?cè)噭?，水為離子交換高純水。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取歐前胡素和異歐前胡素對(duì)照品適量，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備：取本品粉末（過3號(hào)篩）約0.4 g，精密稱定，置容量瓶中，加入甲醇約45 mL，密塞，超聲50 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3 色譜條件的選擇與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Tnature（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱和 WondaCract ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；乙腈-水（48∶52）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)249 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，分離度不得低于1.5，理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)，不得低于5000。

3.2.4 線性關(guān)系考察：分別精密吸取 1.25、2.5、5、10、15、20 mL 歐前胡素貯備液（濃度為 96.5124 μg·mL-1）置 100 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取1.25、2.5、5、10、15、20 mL 異歐前胡素貯備液（濃度為 93.3366 μg·mL-1），置 50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液各20 μL分別注入液相色譜儀，按“3.2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定,以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析。結(jié)果歐前胡素、異歐前胡素分別在24.2～386 ng，46.66～746.6 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為：歐前胡素Y=1.1092X+0.0986,r=1.0000；異歐前胡素Y=0.9281X+0.2390,r=0.9998。

3.2.5 精密度與重復(fù)性試驗(yàn)：取“3.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，歐前胡素和異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.14%和0.30%（n=5），證明精密度良好。

取供試品（1號(hào)樣）6份，各約 0.4 g，精密稱定，按“3.2.3”項(xiàng)下條件測(cè)定，歐前胡素與異歐前胡素含量值RSD依次為0.43%和0.83%（n=6），表明樣品的重復(fù)性良好。

3.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（1號(hào)樣），分別于0 h、5 h、10 h、18 h、24 h進(jìn)行測(cè)定，歐前胡素與異歐前胡素峰面積的RSD依次為0.89%和0.64%（n=5），表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)：取供試品9份，每份約0.20 g（1號(hào)樣，含歐前胡素 2.422 mg·g-1異歐前胡素 0.940 mg·g-1），精密稱定，置容量瓶中。各依次精密加入低、中、高質(zhì)量濃度的歐前胡素對(duì)照品溶液，加入低、中、高質(zhì)量濃度的異歐前胡素對(duì)照品溶液，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“3.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2、表3。

表2 歐前胡素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab2 Results of Imperatiorin recovery tests（n=9）

表3 異歐前胡素范圍與準(zhǔn)確度考察結(jié)果表（n=9）Tab3 Results of Isoimperatorin recovery tests（n=9）

3.2.8 峰一致性及純度試驗(yàn)：對(duì)比二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)供試品與對(duì)照品的保留時(shí)間一致，相應(yīng)的紫外全掃描圖也一致，且均為單一成分。

3.2.9 耐用性試驗(yàn)：換不同廠家、不同型號(hào)的色譜柱和高效液相色譜儀（色譜柱依次為 Tnature C18、WondaCract C18、WondaCract C18，液相色譜儀依次為賽默飛U3000、安捷倫1260、Waters2695），按確定的色譜條件，取重復(fù)實(shí)驗(yàn)中的1號(hào)樣品進(jìn)行測(cè)定。三臺(tái)儀器所測(cè)主峰的峰形良好，并且主峰與其他峰的分離度遠(yuǎn)大于1.5，測(cè)得的歐前胡素的RSD為2.48%，異歐前胡素的RSD為2.44%，表明耐受性良好。

3.2.10 結(jié)果對(duì)比：對(duì)49批白芷樣品進(jìn)行了雙成分測(cè)定，與藥典方法測(cè)定結(jié)果對(duì)比，結(jié)果表明兩種方法所測(cè)結(jié)果基本相同，進(jìn)一步證明此次探索的新方法可行性高。

4 討論

4.1 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟待完善方面：第一，現(xiàn)行藥典薄層鑒別項(xiàng)下所用展開劑均為低沸點(diǎn)試劑，展開過程中容易造成試劑減少以及展開劑比例的變化，使得展距和成分分離效果不佳。針對(duì)上述情況我們進(jìn)行了改進(jìn)，將展開槽放入4℃冰箱的冷藏柜體，效果良好。故建議藥典添加恒溫低溫環(huán)境展開字樣。第二，含量項(xiàng)下流動(dòng)相中，甲醇和水的組合容易導(dǎo)致高效液相柱壓過高，使保留時(shí)間偏移或色譜柱塌陷，為了減少接近等比例的甲醇和水流動(dòng)相造成的高柱壓而選用乙腈-水（48∶52）為流動(dòng)相。第三，二氧化硫熏蒸、藥材性狀顏色變化等均對(duì)含量數(shù)值有影響，應(yīng)加強(qiáng)種植企業(yè)生態(tài)環(huán)境管理以及生產(chǎn)企業(yè)炮制工藝儲(chǔ)存方面的監(jiān)管。

4.2 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)探索發(fā)現(xiàn)問題：經(jīng)過大量試驗(yàn)驗(yàn)證：歐前胡素保留時(shí)間前10～20 min出現(xiàn)的肩峰的高低和大小均與白芷藥材（飲片）品種及質(zhì)量有關(guān)，只要主峰歐前胡素保留時(shí)間前10～20 min出現(xiàn)的前低后高的肩峰，含量項(xiàng)就符合現(xiàn)行藥典的規(guī)定。憑借一張色譜圖即可判斷大致的含量范圍，方法方便快捷，節(jié)省人力物力同時(shí)還大大縮短了檢驗(yàn)周期，故認(rèn)為可用于白芷質(zhì)量的快速初篩。

4.3 含量測(cè)定研究中提取溶劑、方法、時(shí)間及流動(dòng)相的選擇：參考文獻(xiàn)[6]，結(jié)合香豆素類物質(zhì)的溶解性能，選用了乙酸乙酯、乙醚、甲醇、35%乙醇、70%乙醇以及95%乙醇為溶劑，超聲提取發(fā)現(xiàn)70%的乙醇和甲醇對(duì)異歐前胡素的提取效率相當(dāng)，但甲醇對(duì)歐前胡素的提取明顯高于70%的乙醇，故確定甲醇為提取溶劑。分別采用超聲、回流提取方式和不同提取時(shí)間20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、80 min做正交試驗(yàn)考察,結(jié)果顯示兩種方式的提取效率幾近相同，提取時(shí)間為50 min的提取效率最高，因此選擇超聲處理50 min，乙腈-水為流動(dòng)相洗脫測(cè)定歐前胡素和異歐前胡素含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該實(shí)驗(yàn)條件下各成分峰可達(dá)到有效分離且峰形均良好，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證各項(xiàng)數(shù)值均滿足要求，表明新建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法可行。