超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定谷物制品中18種真菌毒素

丘福保，盧麗明，林勝軍，劉國(guó)平

中山市疾病預(yù)防控制中心 (中山 528400)

真菌毒素(mycotoxins)是一類由絲狀真菌在一定的環(huán)境條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，已確認(rèn)化學(xué)結(jié)構(gòu)的真菌毒素有300多種，如黃曲霉毒素、伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2和HT-2毒素等，大部分被證實(shí)具有致癌、致畸和致突變作用，其中黃曲霉毒素B1被公認(rèn)為市目前致癌作用最強(qiáng)的天然物質(zhì)之一[1]。真菌毒素對(duì)谷物及其制品的污染具有普遍性，是比合成污染物、植物毒素、食品添加劑或農(nóng)藥殘留更為重要的食源性風(fēng)險(xiǎn)因子。我國(guó)現(xiàn)行食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)(GB 2761—2017[2])規(guī)定谷物及其制品中黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的最高允許限量，對(duì)其他特殊膳食用食品則有更為嚴(yán)格的要求。

真菌毒素的快速篩查多用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)[3-4]，具有簡(jiǎn)單快速和成本低的優(yōu)點(diǎn)，但定量能力差且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性情況。準(zhǔn)確定性定量方面主要有氣相色譜法(gas chromatography，GC)[5-6]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[7-8]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)，前兩種多用于一種或同一類真菌毒素的定性或定量分析，常需要將真菌毒素衍生化處理，操作頗為復(fù)雜且靈敏度相對(duì)較低，而谷物及其制品中的真菌毒素污染往往是多種毒素同時(shí)存在，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法因靈敏度高、可以多組分同時(shí)測(cè)定而常用于多真菌毒素檢測(cè)研究[9-15]。

樣品在前處理過程中加入同位素內(nèi)標(biāo)可以減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，提取液直接稀釋后上機(jī)在結(jié)果計(jì)算時(shí)容易出現(xiàn)偏差[13]，利用固相萃取柱或免疫親和柱凈化時(shí)檢測(cè)成本較高且回收率未能全面兼顧到各真菌毒素。本研究通過優(yōu)化前處理、色譜和質(zhì)譜條件，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定谷物制品中的18種真菌毒素，可為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中多種真菌毒素檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器和設(shè)備

LC-30AD超高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)；6500+超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國(guó)AB Sciex公司)；Milli-Q Element超純水制備儀(美國(guó)Millipore公司)；千分一電子天平(感量0.001 g，日本SHIMADZU公司)；Real Mix渦旋振蕩器(德國(guó)Heidolph公司)；3-30K低溫超高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)；FW100高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；20目樣品篩(浙江上虞市道墟五四儀器紗篩廠)。

1.1.2試劑

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFT B1)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFT G1)濃度為2.00 mg/L，黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFT B2)、黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFT G2)、黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFT M1)濃度為0.500 mg/L，赭曲霉毒素A(orchatoxin A，OTA)濃度為10.0 mg/L，伏馬毒素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)、伏馬毒素B2(fumonisin B2，F(xiàn)B2)、伏馬毒素B3(fumonisin B3，F(xiàn)B3)、去環(huán)氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deepoxy deoxynivalenol，DOM)濃度為50.0 mg/L，T-2毒素(T-2 toxin，T-2)、HT-2毒素(HT-2 toxin，HT-2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyl-deoxynivalenol，3-AcDON)、15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-acetyl-deoxynivalenol，15-AcDON)、瓜萎鐮刀菌烯醇(nivalenol，NIV)、鐮刀菌烯酮(fusarenon-X，F(xiàn)us X)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)濃度為100 mg/L，以及同位素內(nèi)標(biāo)U-[13C17]-黃曲霉毒素B1、U-[13C17]-黃曲霉毒素B2、U-[13C17]-黃曲霉毒素G1、U-[13C17]-黃曲霉毒素G2、U-[13C17]-黃曲霉毒素M1濃度為0.500 mg/L，U-[13C20]-赭曲霉毒素A、U-[13C34]-伏馬毒素B2、U-[13C34]-伏馬毒素B3濃度為10.0 mg/L，U-[13C24]-T-2毒素、U-[13C22]-HT-2毒素、U-[13C34]-伏馬毒素B1、U-[13C15]-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、U-[13C15]-3-乙?；撗跹└牭毒┐?、U-[13C15]-瓜萎鐮刀菌烯醇、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮濃度為25.0 mg/L(純度均大于99%，奧地利Romer Labs公司)；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國(guó)Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取一定體積上述各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制適宜的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和混合同位素內(nèi)標(biāo)中間液，然后用20%乙腈-水溶液逐級(jí)稀釋，混合中間液和標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度如表1所示，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 18種真菌毒素混合中間液和標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度

1.2.2樣品前處理

稱取2 g(精確至0.001 g)經(jīng)24 000 r/min高速粉碎并過20目樣品篩(孔徑0.850 mm)的谷物制品樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈-水-甲酸溶液(80∶19∶1，v/v/v)渦旋振蕩提取30 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液2 mL氮吹濃縮至干，加入50 μL同位素內(nèi)標(biāo)混合中間液和950 μL 20%乙腈水溶液溶解殘?jiān)筠D(zhuǎn)入1.5 mL帶蓋離心管中14 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm水系微孔濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.2.3儀器條件

色譜：色譜柱，Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相，正離子模式以0.1%甲酸水溶液為水相，負(fù)離子模式以超純水為水相(A)，乙腈為有機(jī)相(B)；梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

質(zhì)譜：電噴霧離子(electrospray ionization，ESI)源：正離子、負(fù)離子分別掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣：9 psi；碰撞氣：30 psi；電噴霧電壓，正離子模式5 000，負(fù)離子模式-4 500；霧化氣：40 psi；輔助氣：40 psi。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過針泵對(duì)18種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行流動(dòng)注射分析，分別在ESI+和ESI-離子化模式下進(jìn)行全掃描(Q1 Scan)選擇合適的母離子，然后在一定的碰撞能量下掃描碎片離子(Product Ion Scan)，選擇相對(duì)豐度最高的碎片離子作為定量離子，次高的作為定性離子，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multi-reaction monitoring，MRM)再優(yōu)化各離子對(duì)的去簇電壓(declustering potential，DP)和碰撞能量(collision energy，CE)。大部分真菌毒素以[M+H]+或[M-H]-作為母離子，而T-2、HT-2及其相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)則以[M+Na]+離子響應(yīng)較高，得到18種真菌毒素及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)和色譜保留時(shí)間t見表3。

表3 18種真菌毒素及15種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)考察了超純水、0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸銨溶液和含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相與甲醇、乙腈作為有機(jī)相的不同組合對(duì)各真菌毒素離子化效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下甲酸的濃度加大時(shí)伏馬毒素的響應(yīng)靈敏度隨之升高，而黃曲霉毒素則剛好相反；乙酸銨的加入對(duì)大部分真菌毒素的峰形沒有明顯改善作用；乙腈作為有機(jī)相時(shí)比甲醇洗脫能力強(qiáng)，峰形較窄且總分析時(shí)間相應(yīng)縮短。因此，最終選擇乙腈作為有機(jī)相，0.1%甲酸水作為正離子模式水相，超純水作為負(fù)離子模式水相。

本試驗(yàn)還分別考察了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)3種色譜柱對(duì)18種真菌毒素的分離效果。結(jié)果顯示HSS T3分離效果優(yōu)于另外兩種色譜柱，特別是對(duì)同分異構(gòu)體FB2和FB3的分離。濃度點(diǎn)5的11種正離子總離子流色譜圖和7種負(fù)離子總離子流色譜圖如圖1和圖2。

注：真菌毒素及其內(nèi)標(biāo)按出峰時(shí)間順序依次為：1.AFTM1；2.AFTG2；3.FB1；4.AFTB2；5.AFTG1；6.AFTB1；7.FB3；8.HT-2；9.FB2；10.T-2；11.OTA。

注：真菌毒素及其內(nèi)標(biāo)按出峰時(shí)間順序依次為：1.NIV；2.DON；3.DOM；4.Fux X；5.15-AcDON；6.3-AcDON；7.ZEN。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

乙腈的極性強(qiáng)于甲醇，文獻(xiàn)中多數(shù)用乙腈-水溶液提取樣品中的真菌毒素，且少量甲酸的加入有利于FBs和OTA等含羥基化合物的提取[13]，本試驗(yàn)以掛面樣品作為本底考察了不同比例的乙腈-水-甲酸溶液對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明，隨著提取溶劑中乙腈比例的提高，各真菌毒素的提取回收率有相對(duì)集中的趨勢(shì)。乙腈-水比例在80%時(shí)，多數(shù)真菌毒素的提取回收率較為合適。最終選擇提取溶劑為乙腈-水-甲酸(80∶19∶1，v/v/v)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

按1.2.1方法配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以同位素內(nèi)標(biāo)法定量。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分別計(jì)算各真菌毒素的檢出限和定量限，稱樣量以2 g計(jì)，結(jié)果如表4所示。

表4 18種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4.2回收率和精密度

選取掛面、方便面和米粉三種不同基質(zhì)的樣品分別加入線性范圍內(nèi)低、中、高3個(gè)濃度水平的18種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2方法處理后上機(jī)測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平平行試驗(yàn)3次?？鄢龢悠繁镜字岛笥?jì)算各自的平均加標(biāo)回收率和室內(nèi)精密度，結(jié)果見表5。

表5 不同樣品基質(zhì)中18種真菌毒素的平均回收率和室內(nèi)精密度(n=3)

2.4.3準(zhǔn)確度

本試驗(yàn)測(cè)定了幾份購(gòu)于Romer labs公司的玉米粉/小麥粉質(zhì)控樣，結(jié)果如表6所示，目標(biāo)真菌毒素的測(cè)定值均在質(zhì)控樣的給出的參考值范圍內(nèi)。

表6 質(zhì)控樣品檢測(cè)結(jié)果(n=2)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件和UPLC-MS/MS方法檢測(cè)市售的掛面、方便面和米粉各10份。結(jié)果顯示，方便面中檢出有AFTB1、FB1、DON和NIV，掛面和米粉檢出有DON和NIV，其他真菌毒素均未檢出，其中有2份掛面和1份方便面的DON含量超過了限量值標(biāo)準(zhǔn)(1 000 μg/kg)。檢測(cè)結(jié)果還顯示當(dāng)DON含量較大時(shí)常常NIV也會(huì)隨之檢出，且DON的含量大概是NIV的十幾倍。說明DON對(duì)谷物制品的污染具有普遍性，可能與農(nóng)作物的儲(chǔ)存和加工環(huán)境有一定的關(guān)系。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件結(jié)合提取后濃縮和同位素內(nèi)標(biāo)校正技術(shù)，建立了分析谷物制品中18種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。該方法具有靈敏度高、前處理成本較低，適用于多種真菌毒素定性和定量檢測(cè)，能夠滿足日常食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)需求。