響應(yīng)面法優(yōu)化啤酒大麥芽黃酮提取工藝的研究

米 智 武曉紅 劉荔貞

(山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，大同 037009) (山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院2，大同 037009)

大麥(HordeumvulgareL.)屬禾本科一年生草本植物，是世界上最主要、最古老的栽培作物之一[1]，一直被認(rèn)為是重要的谷物之一，中國(guó)大麥種植面積和總產(chǎn)量居水稻、小麥、玉米和粟之后，列第五位[2]。其產(chǎn)量在世界糧食作物中居第4位，僅次于小麥、水稻和玉米[3]。

大麥不僅是重要的糧食作物，還是藥用植物、飼料作物和釀酒作物，尤其麥芽具有多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于臨床。大麥籽粒營(yíng)養(yǎng)成分豐富、全面，含有高纖維、高維生素、低脂肪、低糖、多種微量元素以及β-葡聚糖、α-生育三烯醇、黃酮、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、抗性淀粉[4]、多酚、黃酮、類黃酮等功能成分[5，6]。大麥中纖維具有低血糖指數(shù)，對(duì)糖尿病患者日常生理功能維持有益[7]。大麥還富含β-葡聚糖等植物化學(xué)物質(zhì)，其在預(yù)防心血管疾病(CVD)[8]、癌癥[9]和肥胖等常見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)相關(guān)疾病[10]方面有著極其重要的作用。由大麥制成的全麥?zhǔn)称繁徽J(rèn)為是人類的“健康食品”[11]。

大麥麥芽為中醫(yī)臨床上常用的一味消食藥，是由成熟大麥果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥而得。用水浸泡麥粒，保持適宜溫、濕度，待3～6 d幼芽長(zhǎng)至約0.5 cm時(shí)，進(jìn)行干燥即得生麥芽?！吨袊?guó)藥典》載：麥芽甘平行氣消食、健脾開(kāi)胃、退乳消脹，用于食積不消、脾虛食步、乳汁郁積、乳房脹痛、婦女?dāng)嗳?、肝胃氣痛[12]。麥類麥芽中含有豐富的黃酮類化合物、麥芽酚、麥角類化合物、β-葡聚糖、尿囊素、淀粉酶、α-生育三烯酚、轉(zhuǎn)化糖酶、催化酶、過(guò)氧化異構(gòu)酶等。另含α-科醌、大麥芽堿、大麥芽胍堿、腺嘌呤、膽堿、蛋白質(zhì)、氨基酸，維生素B、D、E，細(xì)胞色素等[13-16]。研究發(fā)現(xiàn)，大麥在發(fā)芽過(guò)程中，可分解一些抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生新物質(zhì)或增加已有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量[1]，有助于大麥營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的富集，并且可以極大地提高各種酶的活性，使其保健功效發(fā)揮更充分[17]。Kanauchi等[18-20]研究表明，發(fā)芽大麥具有改善通便、防治腹瀉功效，還對(duì)結(jié)腸炎有較好的預(yù)防和治療作用。

大麥芽中含量豐富的黃酮類化合物是中藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其黃酮類成分主要有兒茶素、蘆丁、橙皮甘、楊梅素、槲皮素和山柰酚[21]等，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗癌防癌等方面的功能[13,22,23]，也能降低血管的脆性及異常的通透性作用，可用作防治高血壓及動(dòng)脈硬化的輔助治療劑，其中兒茶素還具有抗肝臟毒作用，黃酮類化合物二氫槲皮素具有抗炎作用等[24]，麥芽中含有的麥黃酮還有改善記憶，治療老年癡呆癥的功能[25]。麥芽中的類黃酮，對(duì)DNA修復(fù)有一定的作用[13]。

大麥資源雖在我國(guó)非常豐富，但多集中于品種篩選、種植栽培等方面，而對(duì)大麥尤其大麥芽的功能特性、醫(yī)療保健、及其深加工等方面的研究和利用還不夠深入。黃酮的提取方法很多，其中索氏提取法具有選擇性好、能耗低、設(shè)備、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用；黃酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇無(wú)毒且沸點(diǎn)低，適于索氏提取法對(duì)黃酮的提取，且使用乙醇為提取劑時(shí)回收利用方便，得率高，有利于降低生產(chǎn)成本[26]。本研究以啤酒大麥芽為研究對(duì)象，利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)探究索氏提取法提取大麥芽黃酮的最佳工藝條件，為大麥芽黃酮的藥用研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒大麥芽，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)水乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉等。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋、酸度計(jì)、精密電子天平，真空抽濾裝置、數(shù)顯恒溫水浴鍋、紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，高速中藥粉粹機(jī)，索氏提取器等。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加少量乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液[27]。

取6個(gè)干燥潔凈的25 mL容量瓶，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作見(jiàn)表1。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以0號(hào)容量瓶為空白對(duì)照，在510 nm處用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，測(cè)3次求平均值，做回歸處理。

1.3.2 大麥芽處理及黃酮提取工藝流程

選擇無(wú)發(fā)霉、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)病蟲(chóng)害、顆粒飽滿的大麥芽種子，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在50 ℃下干燥2 h后，用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成大麥芽粉末，并使大麥芽粉通過(guò)60目篩，收集大麥芽粉末于干燥的容器中待用。

黃酮提取工藝流程為：大麥芽→清選→烘干→粉碎→過(guò)篩→稱重→分裝小包→乙醇提取浸提→提取液定容→測(cè)定吸光值→計(jì)算提取量

1.3.3 大麥芽總黃酮的測(cè)定方法

精確量取1 mL提取液做為待測(cè)液，方法同1.3.1，在510 nm處測(cè)吸光值，做3組平行實(shí)驗(yàn)求平均值，代入線性回歸方程，得到大麥芽總黃酮的含量公式：

式中：C為大麥芽總黃酮質(zhì)量濃度/mg/mL；N為稀釋的倍數(shù)；V為提取液總體積/mL；W為實(shí)驗(yàn)樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4 大麥芽總黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)[28]

1.3.4.1 乙醇濃度

準(zhǔn)確稱取2 g大麥芽粉末，在料液比(g/mL)為1∶15、提取時(shí)間為1 h、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%提取大麥芽中的總黃酮，并在510 nm處測(cè)定提取液的吸光值，并計(jì)算黃酮提取量。

1.3.4.2 料液比

準(zhǔn)確稱取2 g大麥芽粉末，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取時(shí)間為1 h、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)提取大麥芽中的總黃酮，并在510 nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算黃酮提取量。

1.3.4.3 提取時(shí)間

準(zhǔn)確稱取大麥芽粉末2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶15、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置提取時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3 h提取大麥芽中的總黃酮，并在510 nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算黃酮提取量。

中國(guó)書(shū)畫(huà)千年歷史，不能斷了香火，后輩學(xué)子首先是在老祖宗靈位前嗑頭下跪，老老實(shí)實(shí)把老師那點(diǎn)東西學(xué)到手，添油加柴，把家傳本領(lǐng)好好學(xué)到家。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

根據(jù)大麥芽總黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)3個(gè)因素中，分別選取3個(gè)對(duì)大麥芽總黃酮提取量影響最大的水平，以黃酮提取量為考察目標(biāo)，運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，確定相應(yīng)面試驗(yàn)方案，并建立回歸方程預(yù)測(cè)模型確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.6 大麥芽總黃酮提取工藝的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了更好的證實(shí)索氏提取法提取大麥芽總黃酮的可靠性和合理性，在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值OD510為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為：y=9.107x-0.112，R2=0.993。

2.2 大麥芽總黃酮提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可以得到，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于60%時(shí)，大麥芽黃酮提取量隨乙醇濃度增大而提高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大，約為56 mg/100 g，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%后，隨著乙醇濃度的提高，黃酮提取量反而降低。因此在做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%。

圖1 乙醇濃度、回流時(shí)間和料液比對(duì)大麥芽黃酮提取量的影響

大麥芽黃酮提取量隨著料液比的增大而提高，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，大麥芽黃酮提取量達(dá)到最大值，約為55 mg/100 g，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，黃酮提取量反而降低。因此在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20。

當(dāng)提取時(shí)間不足2 h時(shí)，大麥芽黃酮提取量隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而提高，且提取2 h時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大值，約為58 mg/100 g，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，大麥芽黃酮提取量反而有所降低，因此在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取提取時(shí)間分別為1.5、2、2.5 h。

2.3 回歸模型的建立及其分析

響應(yīng)面分析因素與水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平

響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果

建立啤酒大麥芽黃酮提取工藝參數(shù)的回歸模型，獲得本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)(黃酮提取量)的響應(yīng)值對(duì)自變量A(乙醇濃度)、B(料液比)和C(提取時(shí)間)的二次多項(xiàng)式回歸方程：黃酮提取量=-372.525+9.757 5×A+2119×B+76.6×C+6×AB+0.45×AC+180×BC-0.093 5×A2-18 960×B2-30.4×C2。

回歸模型方差分析見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差分析

以啤酒大麥芽黃酮提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)該模型進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(表4)?；貧w模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈極顯著(P=0.00 63<0.01)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且通過(guò)P值可知模型中變量A2、B2、C2對(duì)提取量影響顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對(duì)相應(yīng)值有很大的關(guān)系，三因素的交互作用影響相對(duì)較??；失擬項(xiàng)P=0.595 8>0.05，不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合度較好，模型的殘差可能來(lái)源于實(shí)驗(yàn)過(guò)程的隨機(jī)誤差。模型的校正決定系數(shù)R2=0.910 1，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)誤差較小，有91.01%來(lái)解釋該模型中響應(yīng)值的變化。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)響應(yīng)值的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間(C)>乙醇濃度(A)>料液比(B)，但這3個(gè)因素均對(duì)黃酮提取量影響均不顯著(P>0.05)。

通過(guò)三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析顯示，隨著乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間的增大或延長(zhǎng)，啤酒大麥芽黃酮提取量也隨之增大，但當(dāng)濃度、料液比和提取時(shí)間增大或延長(zhǎng)到一定程度后，黃酮提取量有下降的趨勢(shì)，三因素之間的交互作用不顯著，等高線圖中的橢圓程度和疏密程度也相當(dāng)，與模型回歸中的方差分析一致。

2.4 最佳提取條件的確定

由響應(yīng)面法試驗(yàn)分析數(shù)據(jù)可得出啤酒大麥芽中黃酮最佳提取取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為59.18%、料液比為1∶14.2 9、提取時(shí)間為1.92 h，最佳提取量為68.43 mg/100 g?？紤]實(shí)驗(yàn)室操作的可行性，修正提取工藝條件乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶15、提取時(shí)間為2 h。

2.5 優(yōu)化條件的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)篩選出大麥芽黃酮提取最佳工藝，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)測(cè)定大麥芽黃酮提取量見(jiàn)表5。3組平行樣數(shù)據(jù)RSD為3.83%，滿足要求，得出該提取工藝大麥芽黃酮提取量較為穩(wěn)定。

表5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)測(cè)定大麥芽黃酮提取量

3 結(jié)論

由響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析可知，索氏提取法提取大麥芽黃酮的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶15和提取時(shí)間為2 h。影響程度為：提取時(shí)間>乙醇濃度>料液比，3個(gè)因素對(duì)大麥芽黃酮提取量影響不顯著。通過(guò)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)可知，該工藝黃酮提取量最高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小(3.83%)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)軐?duì)各個(gè)因素及各因素之間的交互分析更全面，更細(xì)致，較為準(zhǔn)確地分析出因素間最佳組合，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定可靠。