綠豆皮牡荊素提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

杜冠尚，羅 磊，張向輝，夏迎利，段雪瑩

（河南科技大學(xué)，河南洛陽 471000）

0 引言

綠豆（Mung Bean，簡稱M.），別名青小豆，蝶花亞科豇豆屬，在中國已有2 000多年栽培史[1]，年產(chǎn)量約70萬t。綠豆皮是綠豆深加工過程中由于去皮或去渣產(chǎn)生的廢棄物，約占綠豆質(zhì)量的8%左右[2]。這些綠豆皮或加工為廉價飼料或被丟棄，未得到有效利用，造成大量資源浪費。研究表明，綠豆皮含豐富的黃酮、膳食纖維、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，抗氧化抑菌消炎功能遠高于綠豆[3-5]。

牡荊素（Vitexin），碳苷黃酮活性單體[6-7]，其顯著的抑菌能力[8-9]、抗氧化活性[10-12]和神經(jīng)保護作用[13]引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。牡荊素的提取大多從檀香葉、山楂葉、金銀花中提取[14-17]，這些原料本身牡荊素含量少，且提取成本高。而綠豆皮產(chǎn)量豐富，主要抗氧化成分為牡荊素，含量超過綠豆皮黃酮的50%[18-19]，可作良好的牡荊素提取替代原料。目前，關(guān)于綠豆皮黃酮[20]、膳食纖維[21-23]、葉綠素[24]的報道較多，缺乏綠豆皮牡荊素深入研究。

牡荊素溶于有機溶劑，但綠豆皮質(zhì)地堅硬，單純利用有機溶劑提取較難。超聲提取操作簡便、效率高，近年來廣泛應(yīng)用于功能性成分的提取[25-27]。超聲波引起的機械振動加速反應(yīng)進程，綠豆皮細胞壁在碰撞摩擦中軟化，促進有效成分溶出。因此，采用超聲波輔助有機溶劑提取綠豆皮牡荊素，進一步研究其抗氧化活性，為牡荊素提取提供新來源，實現(xiàn)綠豆皮廢物利用，為綠豆皮資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆皮（干燥過篩備用），實驗室自制；牡荊素標準品（HPLC≥98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源葉生物科技有限公司提供；鐵氰化鉀，洛陽市創(chuàng)偉化玻有限公司提供；三氯乙酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；水楊酸，天津市風船化學(xué)試劑科技有限公司提供；鄰苯三酚，上海永葉生物科技有限公司提供；三羥甲基甲烷（Tris Base），上海強順化學(xué)試劑有限公司提供。

Eclassical3100型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；FA1006型分析天平，上?？茖W(xué)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；KQ-500DE型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；SNWTZ-5N型冷凍干燥箱，北京新芝生物儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S6A型水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；FZ102型粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；Eclassical3100型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；HL-2B型數(shù)顯恒流泵，上海馳唐電子有限公司產(chǎn)品；101型電熱鼓風干燥箱，北京科委永興儀器有限公司產(chǎn)品；TDZ5-WS型和H1750型式離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，1.7 μm）；紫外檢測器波長278 nm，柱溫25℃，進樣量20 μL，流速1.0 mL/min；流動相：A為水（0.5%甲酸），B為乙腈（色譜級）；梯度洗脫條件：0～3 min，5%B；3～6 min，10%B；6～9 min，15%B；9～12 min，20%B；12～15 min，25%B；15～20 min，30%B；20～25 min，20%B；25～30 min，10%B；30～35 min，5%B。

1.2.2 綠豆皮牡荊素提取及測定

準確稱取一定量綠豆皮粉于100 mL具塞三角瓶，按比例加入70%乙醇，超聲處理提取，以轉(zhuǎn)速4 800 r/min離心20 min，將上清液旋蒸濃縮后加4倍體積無水乙醇靜置，再次以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心30 min，過膜（0.22 μm），于波長278 nm處測定峰值，代入牡荊素標準曲線（Y=41.997X+16.217，R2=0.999 5），計算提取量。

式中：Y——峰面積；

V——濃縮后體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，mg；

5——稀釋倍數(shù)。

1.2.3 綠豆皮牡荊素提取工藝研究

以牡荊素提取量為指標，考查料液比（1∶3，1∶5，1∶7，1∶9，1∶11，1∶13）、超聲溫度（35，40，45，50，55，60 ℃）、超聲時間 （10，20，30，40，50，60 min）、超聲功率 （200，250，300，350，400，450 W）對提取量的影響。響應(yīng)面優(yōu)化超聲條件，將各因素設(shè)為3個水平。

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計因素與水平設(shè)計

1.2.4 綠豆皮牡荊素體外抗氧化活性研究

提取液旋蒸濃縮至有淡黃色晶體析出，真空冷凍干燥成粉（即綠豆皮牡荊素）備用?？傔€原能力測定及計算參照文獻[28]，DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力測定分別參照文獻[29]、文獻[30]、文獻[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取結(jié)果

2.1.1 超聲提取單因素試驗結(jié)果

超聲條件對牡荊素提取量的影響見圖1。

圖1 超聲條件對牡荊素提取量的影響

由圖1可知，綠豆皮牡荊素提取量隨料液比增大而增加，比例1∶9時，提取量為1.903 mg/g，繼續(xù)加大溶液比例提取量增加緩慢。溶劑多，物質(zhì)間傳質(zhì)動力大，牡荊素易溶出，溶劑過多會延長濃縮時間，因此1∶9為最佳料液比。牡荊素提取量隨超聲溫度升高，增速先快后慢并有下降趨勢，提取溫度為50，55℃時提取量分別為1.916，1.926 mg/g，本著節(jié)能高效原則選擇50℃為最佳溫度。牡荊素提取量隨超聲時間延長先增加后下降，40 min時有最大提取量1.936 mg/g。細胞內(nèi)外存在濃度梯度差，短時超聲為牡荊素溶出提供動力；長時超聲產(chǎn)生的熱能和空化效應(yīng)會破壞牡荊素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此最佳超聲時間為40 min。隨超聲功率的增加，提取量先增加后下降。超聲功率為350 W時綠豆皮牡荊素提取量最大為1.936 mg/g。功率越大，溶劑體系的機械振動越強，牡荊素溶出越快；功率過大空化泡大量積聚，阻礙超聲波在料液之間的傳遞，因此350 W為最佳超聲功率。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取結(jié)果

用Design Expert 8.0.5.0軟件中Box Behnken進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。將數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，方程為：

超聲波提取綠豆皮牡荊素響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，超聲波提取綠豆牡荊素響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析見表3。

表2 超聲波提取綠豆皮牡荊素響應(yīng)面試驗結(jié)果

表3 超聲波提取綠豆牡荊素響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析

由表3可知，CD交互作用極顯著（p＜0.01）、BD交互作用較顯著 （p＜0.05）、模型極顯著（p＜0.01）、失擬項不顯著（p＞0.05），模型設(shè)計合理。模型決定系數(shù)R2=0.986 7，說明模型能解釋98.67%響應(yīng)值變化，擬合程度較好；因變量與自變量之間復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.973 4，說明該模型能較好地反映綠豆皮牡荊素提取量與各因素之間的關(guān)系。F值越大，表明該因素對試驗指標越重要，各因素對牡荊素提取量的影響順序為D＞C＞B＞A。

2.1.3 響應(yīng)面交互作用分析

二次模型所做出的響應(yīng)面可以評價試驗因素對綠豆皮牡荊素提取量的交互作用，并由此確定最佳水平范圍。響應(yīng)值越大，各參數(shù)等高線呈橢圓形，兩因素交互作用越顯著。

各因素交互作用對綠豆皮牡荊素提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖見圖2。

由圖2可知，超聲時間和超聲功率、超聲溫度和超聲功率間等高線圖均為橢圓，對結(jié)果影響極顯著（p＜0.01），前者交互作用較后者顯著，與表3方差分析回歸模型顯著性檢驗結(jié)果一致。

理論最優(yōu)組合為料液比1∶8.88，超聲溫度49.36℃，超聲時間45.71 min，超聲功率339.86 W，提取量為1.958 mg/g。為便于操作，將最優(yōu)組合調(diào)整為料液比1∶9，超聲溫度50℃，超聲時間46 min，超聲功率350 W，驗證最優(yōu)組合得平均提取量為1.966 mg/g，優(yōu)化模型合理。

牡荊素標品（左） 及粗提液（右） HPLC圖見圖3。

圖2 各因素交互作用對綠豆皮牡荊素提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖

由圖3可知，牡荊素粗提液與標準品出峰時間分別為14.728 min和14.739 min，說明提取成分為牡荊素。

2.2 綠豆皮牡荊素體外抗氧化活性分析

2.2.1 綠豆皮牡荊素總還原能力測定結(jié)果

圖3 牡荊素標品及粗提液HPLC圖

總還原力測定是利用鐵離子在酸性條件下化合價變化所引起的顏色變化來判斷的，顏色越深，吸光值越大，還原能力越強。

綠豆皮牡荊素總還原能力見圖4。

圖4 綠豆皮牡荊素總還原能力

由圖4可知，在0.03～0.18 mg/mL內(nèi)，隨質(zhì)量濃度增加，綠豆皮牡荊素總還原力呈上升趨勢。質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時，綠豆皮牡荊素吸光值為0.813，達到維C吸光值1.329半數(shù)以上。

2.2.2 綠豆皮牡荊素DPPH自由基清除結(jié)果

DPPH·結(jié)構(gòu)中含有的孤對電子與自由基清除劑結(jié)合，顏色由深紫色變成淡黃色，褪色程度與DPPH自由基有定量關(guān)系。

綠豆皮牡荊素DPPH自由基清除能力見圖5。

由圖5可知，在質(zhì)量濃度0.03～0.18 mg/mL內(nèi)，綠豆皮牡荊素清除自由基能力呈上升趨勢，質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時，清除率為70.49%，接近同濃度下維C清除率92.34%。兩者DPPH自由基清除的IC50分別為0.119，0.036 mg/mL。

圖5 綠豆皮牡荊素DPPH自由基清除能力

2.2.3 綠豆皮牡荊素羥基自由基清除結(jié)果

H2O2+Fe2+=·OH+H2O+Fe3+反應(yīng)生成的·OH 與水楊酸結(jié)合生成的2,3-二羥基苯甲酸于波長510 nm處有特殊吸收，加入抗氧化劑與水楊酸爭奪羥基自由基，從而減少顯色物質(zhì)生成。

綠豆皮牡荊素羥基自由基清除能力見圖6。

圖6 綠豆皮牡荊素羥基自由基清除能力

由圖6可知，綠豆皮牡荊素質(zhì)量濃度在0.03～0.18 mg/mL時，自由基清除率與其濃度呈明顯正相關(guān)，質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時，清除率61.36%，相當于0.09 mg/mL下維C的清除率。兩者·OH清除的IC50分別為0.132，0.069 mg/mL。

2.2.4 綠豆皮牡荊素超氧陰離子清除結(jié)果

鄰苯三酚在弱堿性條件下自氧化生成超氧陰離子自由基和于波長325 nm處有特征吸收峰的中間產(chǎn)物，抗氧化劑加入后迅速與O2-·反應(yīng)阻止中間產(chǎn)物聚集，因此吸光度值的大小可以間接反映物質(zhì)的抗氧化能力。

綠豆皮牡荊素超氧陰離子清除能力見圖7。

由圖7可知，質(zhì)量濃度在0.03～0.12 mg/mL時，綠豆皮牡荊素超氧陰離子清除率上升迅速，質(zhì)量濃度大于0.12 mg/mL時清除率上升緩慢，質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時，清除率達到63.28%。綠豆皮牡荊素和維C清除O2-·的IC50分別為0.127，0.034 mg/mL。

3 結(jié)論

圖7 綠豆皮牡荊素超氧陰離子清除能力

采用超聲波醇法提取綠豆皮牡荊素，用響應(yīng)面法建模分析。結(jié)果表明，在提取液為70%乙醇條件下，料液比1∶9，超聲溫度50℃，超聲時間46 min，超聲功率350 W，有最大提取量1.966 mg/g，試驗誤差小，模型擬合較好。4種抗氧化試驗均表明綠豆皮牡荊素有較好的抗氧化能力，對不同的自由基，有不同的清除能力。粗提液中牡荊素HPLC色譜圖雖然與牡荊素標品保留時間一致，但仍有雜峰干擾，后期將對粗提液進行純化處理，提高純度。