2016～2020年云南部分地區(qū)禽腺病毒4型檢測(cè)分析

朱麗華 王超 宋建領(lǐng)

（1，云南省玉龍縣龍?bào)脆l(xiāng)畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心 674112；2，云南省玉溪市紅塔區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 653100；3，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 650224）

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV) 4 型屬于腺病毒科、禽腺病毒屬[1]，為無囊膜、雙股線性DNA 病毒，外形呈立體對(duì)稱的二十面體，六鄰體蛋白(Hexon)、五鄰體蛋白(Penton) 和纖維蛋白(Fiber) 構(gòu)成腺病毒的外殼蛋白。FAdV-4 為禽腺病毒中致病性最強(qiáng)的[2]，是引起近年來在我國(guó)爆發(fā)的以心包積液和肝炎為主要特征的病毒性傳染病主要病原，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病1987 年巴基斯坦的安卡拉地區(qū)首次爆發(fā)該病，所以也稱為安卡拉病，根據(jù)典型的臨床特征，又稱為心包積液-肝炎綜合征。1989 年后該病在世界范圍內(nèi)流行，2013 年在我國(guó)散在發(fā)生[3]，2015 年在我國(guó)大面積爆發(fā)[4-6]，2016 年本實(shí)驗(yàn)室在云南省石林縣肉雞群首次檢測(cè)到FAdV-4 病原核酸后，每年分別在云南省昆明市、楚雄周、紅河州、玉溪市等家禽養(yǎng)殖密集區(qū)采集樣品，進(jìn)行FAdV-4 流行情況監(jiān)測(cè)，現(xiàn)將2016 年5 月至2020 年4 月份檢測(cè)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 病料

2016 年5 月至2020 年4 月在云南省昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市等家禽養(yǎng)殖密集區(qū)采集發(fā)病雞肝臟樣品，冷藏送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 主要試劑

DNA 核酸提取試劑盒、PCR 試劑盒和DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)等均購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)（型號(hào)為L(zhǎng)A2-4A1），購(gòu)自ESCO 公司；PCR儀（型號(hào)為9700），購(gòu)自美國(guó)ABI（Applied Biosystems Inc）公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)為2000），購(gòu)自美國(guó)伯樂BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 病料處理

將每個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)每次采集的肝臟組織樣品混合剪碎，按1:5的比例加入滅菌PBS 研磨，研磨的混合物反復(fù)凍融3 次，3000r/min 離心10min，取上清液提取核酸。

2.2 DNA 的提取

按照DNA 核酸提取試劑盒說明書，分別提取上清液的DNA 核酸。

2.3 PCR 檢測(cè)

根據(jù)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的FAdV-4 病毒基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)[7]，設(shè)計(jì)FAdV-4 檢測(cè)引物FAdVF:5-TGCTCGTTGTGGATGGTGAA-3、FAdVR:5-CTCCGTGTTGGGCTGGTC-3，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物564bp。反應(yīng)條件為95℃、5min；95℃、45s，58℃、45s，72℃、45s，35 個(gè)循環(huán)；72℃，10min。1.2%瓊脂糖凝膠，100V 電泳30min，觀察PCR 擴(kuò)增結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 樣品采集情況

2016 年5 月至2020 年4 月在云南省昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市等采集樣品290 場(chǎng)次，昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市采集樣品詳細(xì)信息見表1。其中土雜雞樣品248 場(chǎng)次，蛋雞42 場(chǎng)次。

3.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果

290 場(chǎng)次樣品，F(xiàn)AdV-4 病毒核酸陽性30 場(chǎng)次，陽性率為10.34%，部分陽性樣品PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠結(jié)果見圖1。2016年5 月～2020 年4 月每年FAdV-4 核酸檢測(cè)結(jié)果表明，2020 年1～4 月FAdV-4 感染率最高，2018 年FAdV-4 感染率最低，F(xiàn)AdV-4 核酸檢測(cè)陽性詳細(xì)情況見表2、圖2。在昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市4 個(gè)州市中FAdV-4 感染率最高的是昆明市，F(xiàn)AdV-4 感染率最低的是紅河州，不同區(qū)域樣品病原核酸檢測(cè)詳細(xì)結(jié)果見表3、圖3。檢測(cè)的290 場(chǎng)次樣品中，土雜雞樣品248 場(chǎng)次，F(xiàn)AdV-4 病毒核酸陽性28 場(chǎng)次，陽性率為11.29%，蛋雞42 場(chǎng)次FAdV-4 病毒核酸陽性2 場(chǎng)次，陽性率為4.76%。

表1 樣品采集情況（單位：場(chǎng)次）

表2 樣品病原核酸檢測(cè)結(jié)果（單位：場(chǎng)次、%）

表3 不同區(qū)域樣品病原核酸檢測(cè)結(jié)果（單位：場(chǎng)次、%）

4 討論

FAdV-4 感染家禽后發(fā)病急傳播快，臨床上主要表現(xiàn)為病雞精神沉郁、腹瀉、消瘦、羽毛蓬松，最后死亡，部分急性病例無明顯臨床癥狀突然死亡。剖檢變化主要為心包有淡黃色積液，透明清亮或呈膠凍樣，肝臟腫大、質(zhì)地變脆、易碎，有細(xì)菌感染的出現(xiàn)肝周炎。2016 年本實(shí)驗(yàn)室在云南省石林縣肉雞群首次檢測(cè)到FAdV-4 病原核酸后，至2020 年4 月，檢測(cè)290 場(chǎng)次樣品，發(fā)現(xiàn)土雜雞和蛋雞均有感染，但土雜雞FAdV-4 感染率明顯高于蛋雞感染率，而且土雜雞感染FAdV-4 后死亡率高于蛋雞感染的死亡率，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道肉雞死亡率在20%～80%之間，蛋雞死亡率偏低，夏季多發(fā)，其他季節(jié)也可發(fā)生一致[8]。從監(jiān)測(cè)年度看，2016 年首次在云南檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FAdV-4后，2017 年云南省家禽FAdV-4 感染率升高后，2018 年和2019 年南省家禽FAdV-4 感染率維持在一個(gè)較低水平，2020 年南省家禽FAdV-4 感染率又進(jìn)一步升高，據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省2018 養(yǎng)禽場(chǎng)開始使用FAdV-4 疫苗免疫，2018 年和2019 年家禽FAdV-4 感染率低，說明FAdV-4 疫苗免疫能很好控制該病的流行，2020 年FAdV-4 感染率又升高，是由于病毒在免疫壓力下發(fā)生了變異還是由于新型冠狀病毒肺炎疫情導(dǎo)致的飼養(yǎng)管理水平降低引起的需要進(jìn)一步分析。本文檢測(cè)結(jié)果FAdV-4 感染率最高的是昆明市、感染率最低的是紅河州，可能與昆明市是云南省交通樞紐相關(guān)，是云南省禽蛋、飼料交易的中心城市有關(guān)，云南省的首例FAdV-4 感染也是在昆明市發(fā)現(xiàn)，紅河州在云南省相對(duì)處于溫度比較高的區(qū)域，不利于FAdV-4 的傳播有關(guān)，未見關(guān)于云南省FAdV-4 感染區(qū)域差異性的相關(guān)報(bào)道，因此關(guān)于云南省FAdV-4 感染區(qū)域性差異的原因有待進(jìn)一步研究。本文檢測(cè)到的陽性樣品主要集中在30 日齡左右的土雜雞和開產(chǎn)前蛋雞群，與報(bào)道3～5 周齡的肉雞和10～20 周齡蛋雞易感該病一致[9]，對(duì)檢測(cè)到FAdV-4 陽性雞群，采用高免抗體配合抗生素治療，都取得比較好的治療效果。因此，該病的防控措施除了加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全措施執(zhí)行到位的同時(shí)，主要是在疫區(qū)進(jìn)行疫苗免疫，發(fā)病雞群準(zhǔn)確診斷后，采取針對(duì)性的治療措施都會(huì)取得很好的防控效果。