LC-MS/MS 法同時快速檢測牛肉中12 種β- 受體激動劑的應(yīng)用研究

β- 受體激動劑，俗稱瘦肉精，不是某一種特定的藥物，而是一類藥物，能夠促進瘦肉生長、抑制肥肉生長。當(dāng)它們以超過治療劑量5-10 倍的用量用于家畜飼養(yǎng)時，即有顯著的營養(yǎng)“再分配效應(yīng)”，促進動物體蛋白質(zhì)沉積、促進脂肪分解抑制脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，因此曾被用作牛、羊、禽、豬等畜禽的促生長劑、飼料添加劑。[1-3]

但瘦肉精用量大、作用的時間長、代謝慢，所以在屠宰前到上市，在動物體內(nèi)的殘留量都很大。這個殘留量通過食物進入人體，就使人體漸漸地中毒，如果一次攝入量過大，就會出現(xiàn)異常的生理反應(yīng)，因此而被禁用。人若食用含瘦肉精的肉類后會出現(xiàn)頭暈、惡心、手腳顫抖、心跳加速甚至心臟驟停致昏迷死亡，特別對心律失常、高血壓、青光眼、糖尿病和甲狀腺機能亢進等患者有極大危害。[4-7]

在中國，通常所說的“瘦肉精” 則是指鹽酸克倫特羅。它曾經(jīng)作為藥物用于治療支氣管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用。其它類似藥物還有沙丁胺醇和特布他林等，都因為對人體健康危害過大，造成安全隱患，而在全球遭到禁用。在2001 年12 月27 日、2002 年2 月9 日、4 月9 日，農(nóng)業(yè)部分別下發(fā)文件禁止食品動物使用β- 受體激動劑類藥物作為飼料添加劑（農(nóng)業(yè)部176 號、193 號公告、1519 號條例）[8-12]。

因為能夠促進瘦肉生長、抑制動物脂肪生長，瘦肉精讓豬、牛、羊等牲畜的瘦肉率提高，帶來更多經(jīng)濟價值，國內(nèi)養(yǎng)殖戶不顧農(nóng)業(yè)部的規(guī)定，在飼料中摻入過量瘦肉精，給市場上的肉類食品帶來了嚴(yán)重的安全隱患，所以研究出科學(xué)、高效、快速、準(zhǔn)確的檢測方法十分必要。

目前常用的β- 受體激動劑檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/MS/MS）。其中HPLC 法靈敏度較低，不能滿足痕量檢測要求[13-15]；GC/MS 法除了需要大量的前處理步驟，還要求進行衍生化操作，較為繁瑣；ELISA 法雖然操作簡單，但極容易出現(xiàn)假陽性情況，定性結(jié)果的準(zhǔn)確性較差；只有LC/MS/MS 法具有高效的分離能力和準(zhǔn)確的定性定量能力，被廣泛使用，但此法也因為復(fù)雜耗時的前處理而被詬病[16]。因此建立一種科學(xué)、高效、快速、準(zhǔn)確的檢測方法十分必要。

材料與方法

儀器與試劑

儀器名稱：NexeraX2 超高效液相色譜和8045 電噴霧三重四級桿質(zhì)譜儀（日本島津）、ULPHW-I 超純水機（上海優(yōu)普）、MTN-2800W 氮吹濃縮儀（德國AUTO Science公司）、超聲波清洗機（昆山潔力美）、H1850R 冷凍離心機（湘儀儀器）、TG16-WS 高速離心機（湘儀儀器）、VM-D 渦旋混合器（上海皓莊儀器）、JY2002 百分之一電子天平（舜守恒平儀器）、肉類絞碎機（嘉廚食品機械）、ATX224 萬分之一電子天平（日本島津）；儀器經(jīng)校準(zhǔn)檢定合格后方可使用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液名稱：實驗所用β- 受體激動劑類標(biāo)準(zhǔn)品： 鹽 酸 克 倫 特 羅（Clenbuterol）、 萊 克 多 巴 胺 (Racto pamine）、 沙 丁 胺 醇（Salbutamol）、 特 布 他林（Terbutaline）、 西 馬 特 羅(Cimaterol)、 氯 丙 那 林（Clorprenaline）、 溴 布 特 羅(Brombuterol)、 齊 帕特 羅 (Zilpaterol)、 噴 布 特 羅（Penbutolol)、 馬 布 特 羅（Mabuterol)、 妥 布 特 羅（Tulobuterol)、 非 諾 特 羅（Fenoterol）采購于曼哈格公司。

同位素內(nèi)標(biāo)克倫特羅-D9 (Clenbuterol-D9）、萊 克 多 巴 胺-D3 (Ractopamine-D3）、 沙 丁 胺醇-D3(Salbutero1-D3），購于Dr .Ehrenstorfer 公司。

實驗試劑與耗材：乙腈（上海安譜公司，色譜純）、甲醇（上海安譜，色譜純）、乙酸（山東西亞，色譜純）、甲酸（山東西亞，色譜純）、無水硫酸鎂（國藥集團，分析純）、無水硫酸鈉（國藥集團，分析純）、乙酸銨（國藥集團，分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（國藥集團，分析純）、C18 填料( 天津博納艾杰爾), 粒徑40-60μm、PSA 填料( 天津博納艾杰爾), 粒徑40-60μm、GCB 填料( 天津博納艾杰爾)，粒徑40-60μm；

方法

實驗色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件為：色譜柱： C18色譜柱， 規(guī)格2.1×100mm，粒徑1.9μm；柱溫：32℃；進樣體積：2μL；流速：0.3mL/min；流動相A 是體積濃度為0.1% 甲酸水溶液，流動相B為0.1% 甲酸水溶液[17]，洗脫梯度，洗脫條件見表1；所述初始流動相是體積比為9:1 的0.1% 甲酸水溶液和乙腈的混合液；

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質(zhì)譜條件為： 霧化氣流速：3.0L/min； 干燥氣流速：10.0L/min； 加 熱 氣 流 速：10.0L/min；DL 管 溫 度250℃[18]；加熱氣溫度：350℃；接口電壓：4000V；離子源類型：電噴正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描；氦氣作為碰撞氣，霧化氣和加熱氣均為氮氣，干燥氣為潔凈空氣，各個物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物的主要質(zhì)譜參數(shù)見表2:

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

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混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別稱取10mg 的鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、西馬特羅、氯丙那林、溴布特羅、齊帕特羅、噴布特羅、馬布特羅、妥布特羅、非諾特羅12 種β- 受體激動劑，用甲醇溶解并定容至100mL, 此貯備液濃度為100mg/L，得到混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用0.1% 甲酸水- 乙腈（9:1）來稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度梯度為0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，且每個濃度梯度中均加入有6ng 的同位素內(nèi)標(biāo)物, 同位素內(nèi)標(biāo)物由質(zhì)量比為1:1:1 的克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3 和沙丁胺醇-D3 組成。

混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別稱取10mg 的克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3 和沙丁胺醇-D3 三種β- 受體激動劑內(nèi)標(biāo)物質(zhì), 用甲醇溶解并定容至100mL, 此貯備液濃度為100mg/L，得到混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用0.1% 甲酸水溶液稀釋混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其濃度都相當(dāng)于50ng/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)貯備液需保存在-20℃冰箱中冷凍，有效期一年；混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液需保存在4℃冰箱中冷藏，有效期一周。

混合提取劑的制備

混合提取劑是體積比為2:1:9 的0.25mol/L 乙酸銨水溶液、0.1mol/L 乙二胺四乙酸二鈉水溶液和1.5% 甲酸乙腈溶液的混合液；所述0.25mol/L 乙酸銨水溶液用乙酸調(diào)節(jié)pH 值為5.2[19]。

混合除水試劑的制備

混合除水試劑由質(zhì)量比為3:1 的無水硫酸鎂和無水硫酸鈉組成。

混合凈化試劑的制備

混合凈化試劑由500mg 無水硫酸鎂，75mg N- 丙基乙二胺,100mg 十八烷基鍵合硅膠,25mg 石墨化碳黑組成[20]。

樣品溶液的制備

購買牛肉實驗樣品8 份（每份不少于500g），對市面上購買的實驗樣品（不少于500g）進行絞碎處理，并充分混勻樣品，稱取5.0g 絞碎后的牛肉樣品，向豬肉樣品加入120μL 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和12mL 混合提取劑，旋渦混勻1min，超聲處理20min 后，加入4.0g 混合除水試劑，混勻，10000rpm 離心3min，得到提取液；量取3mL 提取液于離心管，加入混合凈化試劑，漩渦震蕩30s，5000rpm離心1min 后，40℃水浴氮氣吹至近干后，用1mL 初始流動相定容，經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，得到樣品溶液。

上機檢測

用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測樣品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并以β- 受體激動劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以β- 受體激動劑的峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，計算牛肉中β-受體激動劑的含量。

結(jié)果分析

標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線圖

12 種混合合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的圖譜見圖1；

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圖1 12 種混合合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的圖譜

1 沙丁胺醇、2 特布他林、3 西馬特羅、4 萊克多巴胺、5 鹽酸克倫特羅、6 氯丙那林、7 溴布特羅、8 齊帕特羅、9 噴布特羅、10 馬布特羅、11 妥布特羅、12 非諾特羅

控制各個化合物質(zhì)量濃度梯度為0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，以各個標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)，以其標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時要控制待測樣品的質(zhì)量濃度在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的范圍內(nèi)。分析實驗數(shù)據(jù)后得到12 種化合物的線性方程，相關(guān)系數(shù)，保留時間，和檢測低限見表3：

8 份牛肉實驗樣品檢測結(jié)果見表4：

經(jīng)實驗分析，在不同市場上購買的新鮮牛肉均未檢出此方法中講述的12 種β- 受體激動劑。

選取空白基質(zhì)樣品，使用上述前處理方法，儀器分析方法以及耗材和儀器對其進行了添加回收實驗，添加量分別為0.5ng/mL，2.5ng/mL，7.5ng/mL，色譜圖峰型良好，保留時間較穩(wěn)定，能夠滿足檢測需求，實驗結(jié)果見下表5：

表5 可以看出， 本方法的添加回收率為85.37%-97.78%，RSD ≤11.6%，表明本方法可以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性，可達到檢測要求，滿足豬肉中β- 受體激動劑的檢測。

結(jié)果與討論

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本實驗建立一種同時快速檢測牛肉中12 種β- 受體激動劑的LC-MS/MS 法。本方法中12 種β- 受體激動劑在質(zhì)量濃度為0.1ng/mL～10.0ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2 ≥99.85）， 添加回收率為85.37%-97.78%，RSD ≤11.6%。本方法檢測準(zhǔn)確度高、定性準(zhǔn)確快捷、無需對樣品衍生化處理、前處理時間短、減少基質(zhì)干擾、檢測時間短、同時減少有毒試劑的使用，值得推廣使用。

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