甘草黃酮類化合物提取分離的研究進(jìn)展

朱菊花

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

甘草為豆科多年生草本植物，以根和根莖入藥，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[1]。黃酮類化合物為甘草的主要有效成分之一，是一類具有C6—C3—C6基本母核的生物活性較強(qiáng)的天然產(chǎn)物。迄今已從甘草中分離鑒定出300多個黃酮類化合物，其中給出結(jié)構(gòu)和名稱的有150多個。甘草黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗心律失常、抗?jié)?、保肝、解痙、抗菌、抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、酶抑制、調(diào)血脂、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰等多種生物活性[2-3]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健及美容等行業(yè)。有研究表明，甘草黃酮具有抗艾滋病病毒的活性[4]，因而使甘草黃酮類天然產(chǎn)物成為國內(nèi)外新藥研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。現(xiàn)有的甘草黃酮提取分離方法很多，基本原理都是通過物理、化學(xué)方法破壞甘草的細(xì)胞壁，再根據(jù)甘草黃酮的極性及溶解性能的差異來達(dá)到提取分離的目的。現(xiàn)將提取方法和分離方法分述如下。

1 提取方法

1.1 水提法

水提取主要為堿性溶劑提取。但建明等[5]以氫氧化鈉水溶液為提取劑提取甘草渣中黃酮類化合物，結(jié)果表明最佳提取工藝是氫氧化鈉的濃度為0.2mol/L，甘草渣與提取劑之比為1∶14，提取溫度90℃，提取時間0.5h。使用堿性溶劑提取具有試劑價廉易得、提取工藝簡單易控制等特點(diǎn)，但該法存在提取雜質(zhì)多、提取液存放易腐敗變質(zhì)、后續(xù)處理煩瑣等缺點(diǎn)，現(xiàn)已不常使用。

1.2 有機(jī)溶劑提取法

有機(jī)溶劑提取法是目前應(yīng)用最多、工藝較成熟的技術(shù)，通常是將甘草及甘草渣用乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑冷浸[6]、加熱回流[7]提取，提取液中加入石油醚以除去脂質(zhì)，再分別用二氯甲烷、乙醚、丙酮、正丁醇進(jìn)行提取或用堿酸處理和用大孔樹脂處理得到含量和收率較高的甘草黃酮類化合物[7-8]。但采用有機(jī)溶劑提取所得產(chǎn)物的有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高，雜質(zhì)較多，大量有機(jī)溶劑的使用也增加了后續(xù)處理的困難，且會對環(huán)境造成污染。

1.3 超聲波提取法

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，超聲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中草藥有效成分的提取[9]。超聲波能破壞植物的細(xì)胞，從而加速藥材有效成分在溶劑中的溶解，縮短提取時間，提高有效成分的提出率，為中草藥成分的提取提供了一種快速、高效的新方法。李炳奇等[10]采用超聲技術(shù)對甘草中黃酮和甘草酸進(jìn)行聯(lián)合提取，確定了影響提取效果的主要因素，摸索出一套合適的甘草酸和黃酮的提取方法，并通過正交試驗得出影響黃酮提取效果的因素大小順序為提取溫度、超聲功率、固液比、提取時間，最佳提取條件為超聲功率1 000W，超聲時間75min，提取溫度40℃、固液比1∶8。劉紅等[11]研究了超聲條件下不同提取時間對甘草黃酮提取率的影響，結(jié)果表明在室溫下超聲提取80min較合適。王應(yīng)強(qiáng)等[12]比較了水提取、乙醇回流提取和超聲提取3種提取方法，結(jié)果表明超聲提取法優(yōu)于乙醇回流法和水提取法。葛淑俊等[13]采用超聲波提取技術(shù)對甘草離體培養(yǎng)物中總黃酮提取和測定工藝進(jìn)行優(yōu)化，以建立在室內(nèi)篩選高產(chǎn)細(xì)胞系和試管苗株系的方法，結(jié)果表明該工藝準(zhǔn)確度較高、穩(wěn)定性好、簡便可行，為優(yōu)良細(xì)胞系的篩選和試管苗的早期鑒定奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。超聲波提取法因省時、節(jié)能、提取率高等，而在甘草黃酮類成分的提取中顯示出一定的優(yōu)勢。

1.4 微波輔助提取法

微波輔助提取法是基于物質(zhì)的介電性質(zhì)和物質(zhì)的內(nèi)部不同電荷極化不具備跟上交變電場的能力而實現(xiàn)的。微波可直接作用于分子，使分子熱運(yùn)動加劇，從而引起溫度升高，這種熱效應(yīng)使其穿透到介質(zhì)內(nèi)部，快速破壞細(xì)胞壁，使中草藥有效成分更快地分離提取出來[14]。張夢軍等[14]采用微波輔助提取法和水提法進(jìn)行了甘草黃酮提取的對比研究，并利用均勻設(shè)計尋找微波輔助提取甘草黃酮的最佳條件，通過試驗發(fā)現(xiàn)微波輔助提取法的提取效率明顯優(yōu)于水提法。闞微娜等[15]利用微波提取技術(shù)研究了微波提取溶劑、微波功率、輻照時間、液固比、甘草原料、提取次數(shù)對甘草酸和甘草黃酮同時提取的影響，達(dá)到了獲取兩種有效成分最大提取率的目的，確定了最佳的提取工藝路線，既縮短了甘草中有效成分的提取時間，又提高了藥材的綜合利用率。采用超聲-微波協(xié)同萃取法從甘草中提取黃酮，可使樣品介質(zhì)內(nèi)各點(diǎn)受到的作用一致，降低目標(biāo)物與樣品基體的結(jié)合力，加速目標(biāo)物從固相進(jìn)入溶劑的過程，具有省時、節(jié)能、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，可作為甘草黃酮的提取方法之一[16]。

1.5 復(fù)合酶提取法

復(fù)合酶法利用酶解作用破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其提取結(jié)構(gòu)阻力減少，利于中藥有效成分的提取。此法采用生物降解技術(shù)，是一種安全、有效、對環(huán)境無污染的提取方法[17]。高保英等[18]通過試驗對復(fù)合酶法及微波法進(jìn)行了比較，結(jié)果以纖維素酶、果膠酶組成的復(fù)合酶法提取率與微波法相當(dāng)，但復(fù)合酶法僅以水為溶劑，在溫和的反應(yīng)溫度下即可達(dá)到微波提取的效果，且提取成本及耗能均較微波法低。王蕓蕓等[17]采用纖維素酶和果膠酶對甘草渣進(jìn)行酶解，從中提取甘草總黃酮，并與常規(guī)醇提法進(jìn)行比較，結(jié)果復(fù)合酶法提取的游離總黃酮含量提高了1.15倍。復(fù)合酶提取法的不足之處在于提取時間較長，但其提取條件溫和、操作簡單，克服了活性成分在高溫下易分解破壞的缺點(diǎn)，且無污染，對生產(chǎn)設(shè)備沒有特殊要求，可作為提取甘草黃酮的一種新方法，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

1.6 超臨界二氧化碳（CO2）萃取法

超臨界CO2萃取法是20世紀(jì)60年代興起的一種新型分離技術(shù)，清潔、高效、選擇性較好，對環(huán)境無污染。超臨界CO2萃取主要受壓力、萃取時間、溫度、CO2流量、原料粒度及夾帶劑的影響。付玉杰等[19]以萃取溫度、萃取壓力、夾帶劑用量、CO2流量、分離壓力及分離溫度為指標(biāo)，確定超臨界CO2萃取甘草黃酮的最佳工藝條件，并以此最佳工藝與常規(guī)溶劑法（乙醇提?。┻M(jìn)行比較，結(jié)果表明，超臨界CO2萃取法的甘草粗黃酮提取率比常規(guī)溶劑法高2.2倍。此后，付玉杰等[20]又對甘草地上部分（莖葉）的超臨界CO2提取工藝進(jìn)行了研究，考察了壓力、萃取時間、溫度及CO2流量對甘草地上部分總黃酮提取率的影響，結(jié)果表明，超臨界CO2萃取甘草總黃酮的工藝具有提取率高、純度高、溶劑用量少、提取時間短、提取率高和活性成分不易分解破壞的優(yōu)點(diǎn)，符合我國中藥現(xiàn)代化的發(fā)展方向，為工業(yè)化超臨界CO2萃取法生產(chǎn)甘草黃酮提供了研究基礎(chǔ)。

1.7 閃式提取法

閃式提取法是將生物組織加入到提取溶劑中進(jìn)行高速組織勻漿，以提取組織中有效成分。鄧引梅等[21]對比研究了閃式提取、索氏抽提、攪拌提取、超聲波提取對脹果甘草葉總黃酮的提取效果，并利用正交試驗對總黃酮的閃式提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，閃式提取法與其他提取方法相比，具有提取率高、提取時間短、溶劑用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)。此后，鄧引梅等[22]又在單因素試驗基礎(chǔ)上探索了用響應(yīng)面法確定閃式提取甘草葉中總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)的可行性，表明閃式提取法是一種高效、快速的提取方法。閃式提取法為提取甘草黃酮提供了一種新方法，同時也為其他天然產(chǎn)物有效成分的提取提供了可靠的借鑒方法。

1.8 半仿生提取法

半仿生提取法（SBE法）是將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合，從生物藥劑學(xué)的角度為經(jīng)消化道給藥的中藥制劑創(chuàng)立的一種提取新技術(shù)[23]。它模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，采用一定pH的酸水和堿水依次連續(xù)提取，提取液分別濾過、濃縮，制成制劑[24]。目前應(yīng)用此法研究甘草黃酮提取的不多見，程艷芹等[25]采用均勻設(shè)計法以甘草酸含量、總黃酮、總多糖、高效液相色譜總面積、干浸膏得率為指標(biāo)，對甘草的SBE法工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，并結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實際，確定最佳工藝條件為三煎用水的pH依次為6.0，7.5，9.0，煎煮時間依次為2，1，1h。此法適合于工業(yè)化生產(chǎn)，體現(xiàn)中醫(yī)藥治病系綜合成分作用的特點(diǎn)，有利于用單體成分控制制劑質(zhì)量，值得做進(jìn)一步的工藝研究與推廣應(yīng)用。

2 分離技術(shù)

甘草總黃酮化合物的分離方法主要有樹脂吸附法、色譜聯(lián)用技術(shù)、溶劑萃取法、萃取-柱層析結(jié)合分離法等，常用的為前兩種方法。田慶來等[26]采用溶劑萃取法實現(xiàn)了甘草浸提液中水溶性黃酮和甘草酸的分離，但此法萃取不完全，所得甘草黃酮的純度不高，因而應(yīng)用不多。張宇等[27]利用萃取、柱層析相結(jié)合的方法提高目標(biāo)物甘草苷的含量達(dá)到90％以上。色譜聯(lián)用技術(shù)多用于中草藥單體成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定，日本學(xué)者[28-30]就應(yīng)用色譜技術(shù)從甘草浸膏、甘草毛根培養(yǎng)物中提取分離得到多種甘草黃酮類化合物。樹脂吸附法是將中藥水提液、醇提液直接或經(jīng)濃縮得浸膏后溶解于溶劑中，再上大孔樹脂柱，以適當(dāng)溶劑洗脫并收集，從而對中藥有效成分達(dá)到提取分離，近年來廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取分離，根據(jù)孔徑、比表面及構(gòu)成類型分為多種類型。經(jīng)試驗[31-32]篩選得出AB-8型大孔吸附樹脂對甘草總黃酮具有良好的分離純化效果，純度大于50％，符合有效部位研究的要求。另有研究表明[33]，HP-20大孔吸附樹脂能有效提取甘草中的黃酮類成分，一次分離可使黃酮含量達(dá)到53.46％，進(jìn)一步經(jīng)聚酰胺樹脂柱色譜純化后，甘草黃酮含量可達(dá)到90.26％。這些分離技術(shù)為進(jìn)一步分離甘草總黃酮的研究奠定了基礎(chǔ)。

3 小結(jié)

甘草黃酮作為一類生物活性較強(qiáng)的成分，應(yīng)用廣泛，市場需求日益強(qiáng)勁，促使其提取分離技術(shù)得以較快發(fā)展。目前應(yīng)用較多的水提法及溶劑提取法，雖工藝較成熟，但提取效率低，能耗大，后續(xù)處理煩瑣。超聲提取、微波提取以及超聲-微波協(xié)同萃取具有縮短提取時間、提高有效成分提出率的優(yōu)點(diǎn)，但多用于實驗室研究。閃氏提取作為一種高效的提取新技術(shù)，仍需進(jìn)行進(jìn)一步的研究論證。半仿生提取體現(xiàn)了中醫(yī)治病綜合成分作用的特點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，值得做進(jìn)一步的工藝研究。復(fù)合酶提取技術(shù)具有提取條件溫和、操作簡單、對生產(chǎn)設(shè)備沒有特殊要求等優(yōu)點(diǎn)，超臨界CO2萃取技術(shù)具有溶劑用量少、提取時間短、提取率高和含量高的優(yōu)點(diǎn)，且兩種技術(shù)均具有安全、不污染環(huán)境的特點(diǎn)，符合我國中藥現(xiàn)代化的發(fā)展要求，可作為甘草黃酮類化合物工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向。色譜聯(lián)用技術(shù)、大孔吸附樹脂技術(shù)對于甘草黃酮類化合物具有較好的提取分離純化效果，但還存在進(jìn)樣量少、耗時長、有機(jī)溶劑用量大等問題，使對于甘草黃酮類化合物的開發(fā)多限于粗制品，價值較低。因此，選用先進(jìn)的提取分離技術(shù)，特別是加速尋找甘草黃酮類化合物單一成分的提取分離方法，才能更加合理有效地利用甘草資源。

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