基于微流控阻抗傳感器檢測(cè)番茄環(huán)斑病毒

李 琛，許慶鐸，邊 勇

（1. 中國(guó)計(jì)量大學(xué)質(zhì)量與安全工程學(xué)院，杭州 310018；2. 中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026）

0 引 言

近年來(lái)，隨著中國(guó)對(duì)外貿(mào)易持續(xù)擴(kuò)大、國(guó)際旅游更加便捷及跨境電商不斷發(fā)展，中國(guó)國(guó)門生物安全形勢(shì)日趨嚴(yán)峻。外來(lái)有害生物的數(shù)量和種類出現(xiàn)前所未有的增加，危害著中國(guó)農(nóng)業(yè)、生態(tài)環(huán)境，乃至破壞經(jīng)濟(jì)、社會(huì)的穩(wěn)定，威脅國(guó)家安全。番茄環(huán)斑病毒（Tomato Ringspot Virus，ToRSV）作為一種重要的作物病原體，能夠感染大豆、番茄、煙草、葡萄、蘋果等 150 多種農(nóng)作物，導(dǎo)致嚴(yán)重的病害[1-2]。目前，ToRSV 已成為中國(guó)禁止入境的Ⅰ類檢疫性病毒[3]。

國(guó)內(nèi)外檢驗(yàn) ToRSV 的常用方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR。如趙文軍等[4]采用熒光 RT-PCR 在 2 h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了ToRSV 的檢測(cè)；余澍瓊等[5]在PCR 的基礎(chǔ)上采用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）檢測(cè)出ToRSV，相比熒光 RT-PCR 縮短了近一倍時(shí)間；易汪雪等[6]采用多重RT-PCR 檢測(cè)大豆種子中的ToRSV，得到0.58μg/mL 的低檢出限?；?PCR 的檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn) ToRSV 的有效準(zhǔn)確檢測(cè)，但設(shè)計(jì)特異性引物、擴(kuò)增測(cè)序等操作需要專業(yè)人員進(jìn)行，不適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)[7]。近年來(lái)備受關(guān)注的微流控技術(shù)則能夠很好的彌補(bǔ)這一不足。微流控技術(shù)將病毒富集、捕獲、檢測(cè)、分析等過(guò)程集成到一塊幾平方厘米的芯片中[8-10]。1992 年，Manz 等[11]在玻璃上設(shè)計(jì)微通道，從而開(kāi)創(chuàng)了微流控技術(shù)，Gomez 等[12]基于微流控技術(shù)集成制造了第一個(gè)白金叉指陣列電極的硅基微流控芯片，結(jié)合阻抗法研究細(xì)胞的代謝活性。近來(lái)，微流控技術(shù)與電化學(xué)阻抗檢測(cè)方法結(jié)合的微流控阻抗傳感器愈來(lái)愈多應(yīng)用于生物檢測(cè)，且方法創(chuàng)新多樣，如基于微叉指陣列電極[13-14]、基于介電泳技術(shù)（Dielectrophoresis，DEP）[15-16]和基于納米材料（如納米粒子[17-18]、納米孔膜[19-20]和石墨烯[21]等）。不同納米材料聯(lián)用產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)使得微流控阻抗傳感器在高效捕獲病菌病毒和放大阻抗信號(hào)方面的優(yōu)勢(shì)更為顯著[22]，成為近來(lái)微流控阻抗傳感器在生物檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?？傊?，微流控阻抗傳感器具有快速性、特異性、試劑消耗少、無(wú)標(biāo)記檢測(cè)、操作簡(jiǎn)便和易于微型化和自動(dòng)化的儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)的特點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)生物病毒現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的理想方法[23-25]。本文針對(duì)ToRSV 的檢測(cè)問(wèn)題，設(shè)計(jì)制作了嵌有金叉指陣列微電極的微流控芯片，搭建了面向ToRSV 檢測(cè)的微流控阻抗傳感器檢測(cè)平臺(tái)，根據(jù)電化學(xué)檢測(cè)原理得到阻抗譜，利用等效電路闡釋阻抗產(chǎn)生及變化機(jī)理，并進(jìn)行特異性檢測(cè)試驗(yàn)。最后，建立ToRSV 濃度和阻抗之間的定量關(guān)系模型，為ToRSV 的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 微流控阻抗檢測(cè)原理及方法

1.1 微流控阻抗檢測(cè)原理

微流控阻抗檢測(cè)技術(shù)是基于微流控芯片系統(tǒng)，將生物病毒濃度轉(zhuǎn)換為電化學(xué)阻抗信號(hào)并進(jìn)行快速檢測(cè)的方法，其檢測(cè)原理是以微流控芯片系統(tǒng)為平臺(tái)，首先將生物病毒抗體分子固定在微流控芯片中的導(dǎo)電換能器（金叉指陣列微電極）表面，然后將生物病毒的抗原溶液注入到介觀尺度的微流道中，病毒抗原抗體在微流道內(nèi)發(fā)生反應(yīng)后形成特異性復(fù)合物并附著在導(dǎo)電換能器上，使得導(dǎo)電換能器的阻抗特性發(fā)生變化。因此，建立阻抗信號(hào)的變化情況和檢測(cè)物濃度之間的定量關(guān)系以達(dá)到檢測(cè)的目的[26]。

1.2 番茄環(huán)斑病毒樣本溶液制備

1）先于1.5mL 離心管中加入500μL 植物蛋白提取液A、4μL 蛋白穩(wěn)定劑和2μL 蛋白酶抑制劑（以上試劑來(lái)自植物蛋白提取試劑盒C500053，生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)），用恒溫混勻儀（型號(hào) MSC-100，杭州奧盛儀器有限公司）混勻備用；

2）往研缽中倒入液氮，加入帶番茄環(huán)斑病毒的植物葉片研磨充分，裝入上述備好的1.5 mL 離心管中；

3）將離心管放入4°混勻儀中，速度800 r/min，振蕩 1 h，隨后放入 4°冷凍離心機(jī)（型號(hào) 5418R，德國(guó)Eppendorf 公司）中，速度12 000 r/min，離心15 min；

4）提取離心管中的上清液到一個(gè)新的1.5 mL 離心管中，取1μL 分離的上清液，使用超微量分光光度計(jì)（型號(hào)Nanodrop 2000，美國(guó)賽默飛公司）測(cè)定番茄環(huán)斑病毒濃度為26.6 mg/mL，用磷酸鹽緩沖液PBS（0.1 mol/L，pH 值 7.4）分別稀釋至 10、1、0.1、0.01 和 0.001μg/mL，于-80°保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微流控阻抗檢測(cè)芯片和系統(tǒng)

本文設(shè)計(jì)的微流控阻抗檢測(cè)芯片分為三層：基底層、通道層和蓋片層，如圖1 所示。

圖1 微流控芯片示意圖Fig.1 Schematic of microfluidic chip

基底層采用玻璃材質(zhì)，并在玻璃基底表面通過(guò)磁控射頻濺射法噴射Cr 層，其厚度為10 nm，用以提高金箔與玻璃的粘結(jié)效率[27]；在Cr 層表面再噴射金箔層，其厚度為100 nm，并采用濕法蝕刻技術(shù)雕刻出微叉指陣列電極的圖案。 通道層采用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）材質(zhì)，并利用SU-8 陽(yáng)膜刻蝕出介觀尺度的微流道；通道層包括微通道、儲(chǔ)液池和廢液池，微通道與金叉指電極在同一空間內(nèi)形成微反應(yīng)室，抗體與抗原免疫結(jié)合及電極檢測(cè)阻抗信號(hào)均在該區(qū)域進(jìn)行。蓋板層采用PDMS 材質(zhì)，將其覆蓋在通道層之上，保障反應(yīng)空間的密封。

金叉指陣列微電極設(shè)計(jì)圖如圖 2 所示，其設(shè)計(jì)參數(shù)為：金叉指微電極對(duì)數(shù)20 對(duì)、電極高100 nm、長(zhǎng)0.6 mm、寬 15μm、電極間距 15μm。微通道的設(shè)計(jì)參數(shù)為：長(zhǎng)7 mm、寬0.5 mm、深100μm；儲(chǔ)液池和廢液池的參數(shù)為：直徑 3 mm，深 100μm；微反應(yīng)室的體積為：1.2 mm×0.5 mm×0.1 mm=0.06 mL。在蓋片層對(duì)應(yīng)儲(chǔ)液池和廢液池的中心打孔，直徑為0.5 mm，連接導(dǎo)管用于試劑的輸入和排出。

圖2 金叉指陣列微電極設(shè)計(jì)圖Fig.2 Schematic of gold interdigital microelectrodes

微流控芯片阻抗檢測(cè)系統(tǒng)示意圖如圖 3 所示，主要包括驅(qū)動(dòng)模塊、反應(yīng)模塊和檢測(cè)模塊。驅(qū)動(dòng)模塊為微量注射泵（型號(hào)Harvard，美國(guó)Harvard Apparatus 公司），注射泵通過(guò)直徑為0.5 mm 的鋼針和軟導(dǎo)管與微流控芯片的入口相連，以便將病毒檢測(cè)樣品及相關(guān)試劑按規(guī)定速率注入微流控芯片中；反應(yīng)模塊包括微流控芯片、金叉指電極，為樣品從捕捉到免疫反應(yīng)過(guò)程中現(xiàn)象的產(chǎn)生，以及阻抗變化信號(hào)產(chǎn)生提供反應(yīng)平臺(tái)；檢測(cè)模塊包括電化學(xué)工作站（型號(hào) CS350，武漢科斯特科技有限公司）和計(jì)算機(jī)，電化學(xué)工作站與微流控芯片的金叉指微電極連接，對(duì)金叉指電極上產(chǎn)生的阻抗變化信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算機(jī)配套軟件進(jìn)行分析。

圖3 微流控阻抗檢測(cè)系統(tǒng)示意圖Fig.3 Schematic diagram of the microfluidic impedance detection system

1.4 試驗(yàn)方法

將注射泵注入流速設(shè)定為10μL/min，電化學(xué)工作站阻抗測(cè)試參數(shù)設(shè)定為：交流激勵(lì)電壓為100 mV，測(cè)試頻率為1～100 kHz。按照下列步驟進(jìn)行試驗(yàn)：

1）裸電極測(cè)量：注入PBS 緩沖液測(cè)量裸電極的阻抗值，測(cè)量完成后持續(xù)注入超純水3 min 清洗微通道及微電極；

2）抗體固定：注入 15μL 濃度為 0.5 mg/mL 的 ToRSV單克隆抗體（GenScript USA Inc 生產(chǎn)）使之充滿微通道，靜置2 h。此時(shí)，PBS 緩沖溶液的pH 值為7.4、離子濃度為0.1 mol/mL，該條件下的PBS 緩沖液具有鹽平衡和穩(wěn)定 H+的作用，抗體蛋白在吸附過(guò)程中不會(huì)受 pH 和離子濃度的影響，從而會(huì)被穩(wěn)定地非特異性吸附在金電極表面。因此，在此條件下蛋白對(duì)固體材料的吸附性較好，抗體會(huì)被非特異性地吸附在金電極表面。2 h 之后用超純水清洗除去未吸附的抗體，注入PBS 緩沖液測(cè)量阻抗值，測(cè)量完成后重復(fù)清洗操作。

3）BSA 封閉：注入15μL 1%BSA 溶液（北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)），靜置30 min，其作用為封閉未被抗體附著的金電極表面，以免產(chǎn)生多余的干擾信號(hào)。30 min 后清洗掉多余的BSA，注入PBS 緩沖液測(cè)量阻抗值，測(cè)量完成后重復(fù)清洗操作。

4）ToRSV 檢測(cè)：注入 15μL 的 ToRSV 樣品，靜置30 min，測(cè)量阻抗值，測(cè)量完成后重復(fù)清洗操作，直至阻抗與裸電極測(cè)量時(shí)相似。

2 結(jié)果與分析

2.1 阻抗值與相角分析

利用CS350 電化學(xué)工作站在1～100 kHz 的頻率范圍內(nèi)測(cè)得50 個(gè)點(diǎn)的阻抗值和相位值，得到如下阻抗與檢測(cè)頻率以及相角與檢測(cè)頻率關(guān)系曲線，如圖4 所示。

圖4 不同溶液的阻抗(Z)-頻率(f)、相角-頻率(f)曲線Fig.4 Impedance(Z)-frequency(f) and phase angle-frequency(f)curves of different solutions

圖4 為不同階段的阻抗-頻率、相角-頻率關(guān)系曲線。圖4a 中，檢測(cè)頻率范圍為1～105Hz，分別測(cè)得裸電極、抗體固定、BSA 封閉電極等不同階段、不同病毒濃度對(duì)應(yīng)的阻抗值。由于檢測(cè)頻率對(duì)阻抗的影響，阻抗-頻率呈現(xiàn)如下趨勢(shì)：在1～103Hz 的低頻范圍內(nèi)，阻抗值隨著頻率的降低逐漸趨于平穩(wěn)；在1 ～100 kHz 的高頻范圍內(nèi)，阻抗值隨著頻率的降低呈線性增加的趨勢(shì)，并且各步驟下所測(cè)的阻抗值大小并無(wú)明顯區(qū)別。此外，相比于裸電極而言，在對(duì)單一PBS 緩沖液、抗體固定后以及BSA 封閉電極后的電極阻抗進(jìn)行測(cè)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，電極阻抗進(jìn)一步提高，說(shuō)明抗體成功固定在電極表面，且BSA 成功封閉電極中的裸露區(qū)域；當(dāng)抗體捕獲ToRSV 并發(fā)生反應(yīng)后，使得電極阻抗值進(jìn)一步增加，且ToRSV 濃度越高，阻抗值增幅也越大。阻抗值增加的原因是由于電極表面的抗體免疫結(jié)合病毒抗原，導(dǎo)致電極指間離子流動(dòng)和電子轉(zhuǎn)移受阻，且病毒濃度與阻礙能力成正比，病毒濃度越高，離子流動(dòng)和電子轉(zhuǎn)移能力受阻程度越大，因此導(dǎo)致電極阻抗增加。

圖4b 檢測(cè)頻率的范圍為1～105Hz，在裸電極、抗體固定、BSA 封閉電極等不同階段時(shí)，不同病毒濃度的相角變化曲線。相位角為-90°時(shí)說(shuō)明該體系是純電容體系，相位角為0°時(shí)說(shuō)明該體系是純電阻體系[28]。如圖4 所示，在低頻范圍內(nèi)（1～103Hz）相位角最低為-10°至-40°，在高頻范圍內(nèi)（1 ～100 kHz）相位角最高能接近-90°，說(shuō)明阻抗的產(chǎn)生在高頻區(qū)由容抗（電容特性）占主導(dǎo)，在低頻區(qū)由阻抗（電阻特性）占主導(dǎo)。

2.2 等效電路

2.2.1 等效電路的建立

為了更好地分析高、低頻區(qū)下的電化學(xué)阻抗譜，建立了面向ToRSV 檢測(cè)的等效電路模型。等效電路模型如圖5 所示，包括：溶液電阻（Rs）、電子轉(zhuǎn)移電阻（Ret）、雙電層電容（Cdl）和介電電容（Cdi）。當(dāng)電極浸入電解液中時(shí)，電極表面與溶液表面如同電容極板，同時(shí)在電極表面產(chǎn)生兩層電荷，從而構(gòu)成雙電層電容Cdl，雙電層電容Cdl表征離子對(duì)電極、溶液界面處電容的影響；電子轉(zhuǎn)移電阻Ret表征電極表面上電子轉(zhuǎn)移到溶液時(shí)生成的電阻；雙電層電容Cdl與電子轉(zhuǎn)移電阻Ret并聯(lián)，表征金叉指電極表面與溶液之間的界面所形成的阻抗。Rs表征測(cè)試溶液電阻，與雙電層電容Cdl和電子轉(zhuǎn)移電阻Ret的并聯(lián)電路串聯(lián)；Cdi表征測(cè)試溶液的介電電容，與溶液電阻Rs、雙電層電容Cdl和電子轉(zhuǎn)移電阻Ret的電路并聯(lián)。

圖5 等效電路圖Fig.5 Diagram of equivalent circuit

2.2.2 等效電路的擬合

采用 ZView 電化學(xué)阻抗分析軟件建立等效電路模型，并利用復(fù)雜非線性最小二乘法，對(duì)50 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行等效電路擬合，擬合采用Levenberg-Marquardt 迭代擬合，得到的擬合曲線為公式（1）、（2）。在擬合值與實(shí)測(cè)值的比較中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的擬合曲線和實(shí)測(cè)點(diǎn)值切合度較高，因此選取10μg/mL 濃度病毒抗原的阻抗值和相角實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)與等效電路擬合曲線加以分析該等效電路的有效性，如圖 6 所示。擬合曲線和實(shí)測(cè)曲線比較可得，阻抗值的誤差絕對(duì)值的平均值為 0.8%，最大誤差為11.9%；相角的誤差絕對(duì)值的平均值為0.7°，最大誤差為5.5°。依次對(duì)濃度為 1、0.1、0.01 和 0.001μg/mL 的病毒抗原進(jìn)行實(shí)測(cè)試驗(yàn)與擬合試驗(yàn)，阻抗值誤差絕對(duì)值的平均值分別為0.6%、1.1%、1.2%、0.5%，相角擬合誤差絕對(duì)值的平均值分別為 0.8°、0.8°、0.5°、0.8°、1.4°。試驗(yàn)結(jié)果表明，擬合曲線的擬合效果良好，本文設(shè)計(jì)的等效電路模型與微流控阻抗傳感器具有較好的擬合一致性。

圖 6 10 μg·mL-1 ToRSV 阻抗、相角擬合圖Fig.6 Fitted curves of impedance and phase angle of 10 μg·mL-1 ToRSV

等效電路中的 2 條支路Rs+Ret+Cdl和Cdi在2 個(gè)不同的頻率范圍內(nèi)控制著電流的流動(dòng)。在低頻區(qū)（1～1 kHz），施加的電壓頻率不足以使電流通過(guò)病毒外殼的脂膜，因此捕獲的病毒相當(dāng)于絕緣體。等效電路中相當(dāng)于電流不經(jīng)過(guò)介電電容Cdi這條支路，介電電容Cdi不做功，阻抗的產(chǎn)生由Rs+Ret+Cdl支路占主導(dǎo)，其阻抗值計(jì)算符合公式（2）。在高頻區(qū)（1 ～100 k Hz），施加的電壓頻率足以使電流通過(guò)病毒外殼的脂膜，從而電流流經(jīng)Cdi支路，此時(shí)Rs+Ret+Cdl支路不做功，阻抗的產(chǎn)生由Cdi支路占主導(dǎo)，其阻抗值計(jì)算符合公式（3）。

電子轉(zhuǎn)移電阻與雙電層電容Ret∥Cdl的并聯(lián)元件阻抗值計(jì)算符合電阻和電容并聯(lián)時(shí)的阻抗計(jì)算公式[29]

式中Z1表示低頻區(qū)內(nèi)由Rs+Cdl+Ret支路所產(chǎn)生的阻抗，?；Z2表示高頻區(qū)內(nèi)Cdi支路所產(chǎn)生的阻抗，?。

2.2.3 等效電路元件對(duì)阻抗值的影響分析

為了研究阻抗變化機(jī)理，本文對(duì)等效電路各元件對(duì)阻抗值的影響進(jìn)行模擬。等效電路元件在不同檢測(cè)工況下的模擬值如表1所示，同時(shí)將BSA封閉電極后檢測(cè)PBS緩沖液的實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照組。

表1 不同等效電路各元件模擬值Table 1 Analog values of each component with different equivalent circuits

由表 1 可得，與對(duì)照試驗(yàn)相比，當(dāng)病毒濃度增加至10μg/mL 時(shí)，溶液電阻Rs從 200.71 增加到 559.78 k?，變化量為359.07 k?，較對(duì)照值200.71 k? 相比，變化率為178.9%；電子轉(zhuǎn)移電阻Ret從67.23 增加到251 k?，變化量為183.77 k?，變化率為273.3%；雙電層電容Cdl從194.03 減少到31.22 nf，變化量為-162.81 k?，變化率為了-83.9%；溶液介電電容Cdi的變化量為-0.09 nf，變化率為-3.2%。

在高頻區(qū)，阻抗的產(chǎn)生主要由溶液介電電容Cdi占主導(dǎo)，而溶液介電電容Cdi的值基本不變，在低頻區(qū)，雖然雙電層電容Cdl隨著捕獲病毒濃度增加而減少，其平均阻抗變化值約38.9 k?，約占總阻抗值變化的7.2%，表明雙電層電容的變化對(duì)阻抗值的變化有微小的影響。溶液電阻Rs和電子轉(zhuǎn)移電阻Ret隨著捕獲病毒濃度增加而顯著增加，且占總阻抗值變化的92.8%，表明阻抗的變化由溶液電阻Rs和電子轉(zhuǎn)移電阻Ret占主導(dǎo)作用。造成溶液電阻Rs及電子轉(zhuǎn)移電阻Ret增加的因素是一致的，即：ToRSV抗體捕捉病毒，使電極表面與溶液交界處、電極指間電子轉(zhuǎn)移和離子流動(dòng)受阻。

2.3 ToRSV 濃度檢測(cè)

ToRSV 檢測(cè)濃度由某一檢測(cè)頻率下的阻抗響應(yīng)關(guān)系決定，選擇合適的檢測(cè)頻率能夠得到較好的阻抗響應(yīng)，從而優(yōu)化傳感器的檢測(cè)靈敏度。在相鄰頻率梯度內(nèi)，阻抗差值越大則表明檢測(cè)頻率越佳。

圖7 為各病毒濃度的平均阻抗差值?Z變化曲線，?Z是基于3 次重復(fù)測(cè)試下病毒樣品的阻抗值減去陰性對(duì)照試驗(yàn)所測(cè)的阻抗值計(jì)算均值所得。?Z的變化具有相同的趨勢(shì)：在低頻區(qū)內(nèi)（1～1 kHz），?Z先增加后減少，最大平均阻抗差值落在10.7 Hz 頻率上，且該頻率下各相鄰濃度之間?Z的變化幅度也最大；在高頻區(qū)內(nèi)（1～100 kHz），?Z幾乎重合且接近于0；綜上認(rèn)為10.7 Hz 是本文設(shè)計(jì)的微流控阻抗傳感器檢測(cè)ToRSV 的最佳檢測(cè)頻率。

圖7 不同濃度病毒的阻抗差值Fig.7 Variation of impedance of different concentrations of virus

圖8 顯示了在最佳檢測(cè)頻率10.7 Hz 時(shí)各病毒濃度與阻抗值Z的對(duì)應(yīng)關(guān)系，在0.001～10μg/mL 病毒濃度范圍內(nèi)，病毒濃度C和阻抗值Z可表達(dá)為

檢測(cè)限設(shè)為空白信號(hào)+3 倍信噪比，其中噪聲定義為控制對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到此微流控阻抗傳感器的檢測(cè)限為0.003 4μg/mL，對(duì)應(yīng)的阻抗值為307.05 k?。

圖8 最佳檢測(cè)頻率（10.7 Hz）下的濃度-阻抗關(guān)系Fig.8 Concentration-impedance at the optimal detection frequency

表2 總結(jié)了番茄環(huán)斑病毒ToRSV 的其他檢測(cè)方法，相比之下，基于微流控阻抗傳感器檢測(cè)ToRSV 具有快速、簡(jiǎn)便和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。

表2 ToRSV 的檢測(cè)方法比較[30-32]Table 2 Comparison of ToRSV detection methods

2.4 特異性檢驗(yàn)

本文使用南方菜豆花葉病毒（Southern Bean Mosaic Virus，SBMV）、南芥菜花葉病毒（Arabis Mosaic Virus，ArMV）和煙草環(huán)斑病毒（Tobacco Ringspot Virus，TRSV）作為非靶向病毒來(lái)驗(yàn)證 ToRSV 的檢驗(yàn)特異性。分別對(duì)10μg/mL SBMV 溶液、10μg/mL ArMV 溶液、10μg/mL TRSV 溶液和 10μg/mL 混合 SBMV、ArMV、TRSV、ToRSV 4 種病毒的溶液進(jìn)行3 次重復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)，仍以BSA封閉電極后測(cè)PBS 緩沖液的阻抗作為陰性對(duì)照得到阻抗差值。

圖9 不同病毒的阻抗差值Fig.9 Variation of impedance of different viruses

不同病毒的阻抗差值圖如圖9 所示，混合4 種病毒溶液的阻抗差值與 ToRSV 溶液的阻抗差值接近；而同濃度SBMV 溶液、ArMV 溶液和TRSV 溶液的阻抗值接近于對(duì)照組，與 ToRSV 溶液阻抗值相差較大。試驗(yàn)結(jié)果表明：本文設(shè)計(jì)的面向 ToRSV 檢測(cè)的微流控阻抗傳感器能夠從ToRSV 單一溶液及含有ToRSV 的多種混合溶液中檢測(cè)出ToRSV，同時(shí)對(duì)其他病毒檢測(cè)無(wú)效。因此，證明了該傳感器對(duì) ToRSV 具有較好的檢測(cè)特異針對(duì)性和有效性。

3 結(jié) 論

1）本文設(shè)計(jì)了一種面向 ToRSV 檢測(cè)的微流控阻抗傳感器。將ToRSV 抗體固定于微流控芯片流道中的金叉指陣列微電極表面，通過(guò)抗體與ToRSV 的免疫結(jié)合引起阻抗變化，并構(gòu)建電化學(xué)阻抗譜；

2）針對(duì)阻抗產(chǎn)生及變化機(jī)理的研究，提出了一種新的面向ToRSV 檢測(cè)的等效電路模型，并對(duì)濃度為1、0.1、0.01和0.001μg/mL 的病毒抗原分別進(jìn)行實(shí)測(cè)試驗(yàn)與擬合試驗(yàn)，阻抗值平均誤差分別為0.6%、1.1%、1.2%、0.5%，相角擬合平均誤差分別為 0.8°、0.8°、0.5°、0.8°、1.4°，證明了等效電路模型與所設(shè)計(jì)的微流控阻抗傳感器具有較好的擬合一致性。

3）利用阻抗差值顯著性區(qū)分最佳頻率的方法，確定了ToRSV 濃度檢測(cè)的最佳頻率為10.7 Hz，建立了ToRSV濃度C與阻抗值Z的計(jì)算模型，并對(duì)檢測(cè)特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的微流控阻抗傳感器檢測(cè)限為0.003 4ug/mL，且具有較好的檢測(cè)特異性和有效性。