新疆小麥籽粒過(guò)氧化物酶(POD)活性檢測(cè)及其基因等位變異檢測(cè)

王麗麗，戰(zhàn)帥帥，謝 磊，王繼慶，哈尼開(kāi)·馬坎，任 毅，時(shí) 佳，耿洪偉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一[1-3]。品質(zhì)已成為我國(guó)小麥主要育種目標(biāo)，同時(shí)影響我國(guó)小麥產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力[4]。面粉和面制品的顏色對(duì)小麥磨粉品質(zhì)有重要影響[5]。面粉中蛋白質(zhì)含量、氧化酶類活性以及色素類物質(zhì)的積累對(duì)面粉及其制品的顏色有顯著影響[6-8]。過(guò)氧化物酶(POD, Peroxidase)是由多基因家族基因編碼的蛋白[2]，廣泛存在于所有生物體中，能氧化各種氫供體，如酚類物質(zhì)、胺、抗壞血酸、吲哚和某些無(wú)機(jī)離子[9]。小麥籽粒中的POD活性對(duì)面粉色澤具有褐變和漂白的雙重作用，是影響面包、饅頭、面條白度的重要因素，POD活性高的小麥品種(系)面粉白度更高[10]。小麥籽粒過(guò)氧化物酶(POD，Peroxidase)活性對(duì)小麥加工品質(zhì)和面粉色澤具有重要影響。研究小麥籽粒POD，對(duì)小麥面粉顏色及加工品質(zhì)的改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】POD活性受遺傳因子、生態(tài)環(huán)境和栽培措施等影響，但主要受遺傳控制[11,12]。在禾本科作物中，普通小麥POD活性是燕麥、水稻和玉米的3～7倍[13]，且顯著高于(P<0.05)硬粒小麥[14-15]。在普通小麥的不同品種(系)間POD活性也可相差3～10倍[16-17]。通過(guò)遺傳途徑培育高POD活性品種(系)是可行的[18]。Rebordinos等[19]利用同源線性定位研究表明，普通小麥POD活性基因位于第3和第7同源染色體組上，尤其是第3同源染色體。Brenchley等[20]研究表明，POD基因類型多，分布廣，在A，B，D組中都有分布，Sareini等(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF525425)克隆了普通小麥籽粒中的Class Ⅲ型POD活性基因(WP1)的全長(zhǎng)序列(AF525425)。魏景欣[3]選用豆麥/石 4185 RIL 群體結(jié)合90K的iSelect基因芯片進(jìn)行POD活性基因定位，發(fā)現(xiàn)QPod.caas-3AL、QPod.caas-4BS和QPod.caas-5AS3個(gè)主效位點(diǎn)，基于效應(yīng)值大的QPod.caas-3AL位點(diǎn)進(jìn)行同源克隆，克隆了3A染色體POD基因TaPod-A1基因組DNA(gDNA)全長(zhǎng)編碼序列并且開(kāi)發(fā)了一對(duì)顯性互補(bǔ)功能標(biāo)記POD-3A1/POD-3A2。時(shí)佳等[18]選用黃淮麥區(qū)材料151份與北部冬麥區(qū)82份品種(系)結(jié)合90K iSelect芯片對(duì)小麥品種(系)籽粒POD活性基因進(jìn)行GWAS，發(fā)現(xiàn)2A、2D、5A、6A、7B和7D等多個(gè)穩(wěn)定遺傳的位點(diǎn)，基于效應(yīng)值大的7D位點(diǎn)進(jìn)行同源克隆，克隆了7D染色體TaPod-D1基因gDNA全長(zhǎng)編碼序列并且開(kāi)發(fā)了一對(duì)顯性互補(bǔ)功能標(biāo)記利用POD-7D1/POD-7D6。耿洪偉等[8]利用TaPod-A1位點(diǎn)功能標(biāo)記POD-3A1/POD-3A2對(duì)129份新疆小麥品種(系)標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，新疆小麥品種(系)以含有低POD活性相關(guān)的TaPod-A1a(的等位變異類型為主。謝磊等[21]利用TaPod-D1位點(diǎn)的功能標(biāo)記POD-7D1/POD-7D6對(duì)98份新疆冬小麥品種(系)進(jìn)行分子檢測(cè)顯示，新疆冬小麥品種(系)以含有低POD活性相關(guān)的TaPod-A1a的等位變異類型為主?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然前人已有對(duì)新疆小麥POD活性相關(guān)基因等位變異分布情況的報(bào)道，但尚未有新疆小麥POD活性及新疆春小麥TaPod-D1基因的等位變異分布情況的報(bào)道。研究新疆小麥品種(系)過(guò)氧化物酶活性高低并分析相關(guān)基因變異類型和分布?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)113份新疆小麥品種(系)進(jìn)行POD活性檢測(cè)，結(jié)合POD-3A1/POD-3A2和POD-7D1/POD-7D6分子標(biāo)記結(jié)果，研究新疆小麥品種(系)TaPod-A1和TaPod-D1基因的等位變異分布頻率及其與POD活性之間的關(guān)系，驗(yàn)證分子標(biāo)記POD-3A1/POD-3A2和POD-7D1/POD-7D6的有效性，為利用分子標(biāo)記選擇高POD活性小麥品種(系)和改良新疆小麥面粉品質(zhì)奠定理論和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用113份新疆小麥品種(系)為供試材料，其中89份新疆冬小麥品種(系)和24份新疆春小麥品種(系)；冬小麥品種(系)包括16份地方品種(系)、34份引進(jìn)品種(系)和39份自育品種(系)，春小麥品種(系)包括4份早期品種(系)(2000年前審定)和20份近期品種(系)(2000年后審定)。所有冬小麥材料均于2016～2017和2017～2018年2個(gè)年度播種于新疆農(nóng)科院瑪納斯試驗(yàn)站，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2 m行長(zhǎng)，每行120粒，行距20 cm，每個(gè)品種(系)種植3行，2次重復(fù)。田間管理與當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)一致，成熟收獲后，人工脫粒。

1.2 方 法

1.2.1 POD活性檢測(cè)

稱取15 g去雜去劣的小麥籽粒采用配備0.8 mm篩子的旋風(fēng)磨(瑞典LaboratoryMill 120)研磨成全麥粉放置于4℃待測(cè)。采用魏景欣等[3]方法，測(cè)定POD活性，2次重復(fù)，若2次檢測(cè)的結(jié)果相差超過(guò)10%，需重復(fù)檢測(cè)。單位POD活性(U)被定義為每克全麥粉每分鐘反應(yīng)產(chǎn)物在470 nm處的吸光度增加0.01。

1.2.2 POD活性分子標(biāo)記檢測(cè)

耿洪偉等[8]已對(duì)新疆冬小麥品種(系)進(jìn)行TaPod-A1和TaPod-D1位點(diǎn)的等位變異檢測(cè)，謝磊等[21]也對(duì)新疆春小麥品種(系)進(jìn)行了TaPod-D1位點(diǎn)的等位變異檢測(cè)，研究采用耿洪偉等[22]的方法，取3粒有代表性的種子提取基因組DNA，隨后利用時(shí)佳等[18]開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記POD-7D1/POD-7D6檢測(cè)24份新疆春小麥品種(系)，根據(jù)每個(gè)小麥品種(系)DNA標(biāo)記結(jié)果判斷其基因型。表1

表1 用于檢測(cè)POD活性基因的分子標(biāo)記及其引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和相關(guān)性分析，采用IBM SPSS statistics 21對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型小麥的POD活性

研究表明，新疆小麥品種(系)的POD活性分布范圍很廣(730～4 600 U/(g·min))，最高、最低POD活性相差6倍，其POD平均活性為2 436.5 U/(g·min)，不同年份間POD活性相關(guān)系數(shù)為0.6(P<0.01)。新疆春小麥的POD活性(2 507.8 U/(g·min))高于新疆冬小麥的POD平均活性(2 417.2 U/(g·min))。在新疆冬小麥中，POD活性表現(xiàn)為引進(jìn)品種(系)(活性為2 501.7 U/(g·min))>地方品種(系)(2 473.9 U/(g·min))>自育品種(系)(2 320.3 U/(g·min))；在新疆春小麥中，POD活性表現(xiàn)為近期品種(系)(2 524.0 U/(g·min))>早期品種(系)(2 426.9 U/(g·min))。表2

表2 不同類型新疆小麥品種(系)的POD活性

2.2 2個(gè)基因位點(diǎn)不同等位變異的POD活性

研究表明，在TaPod-A1位點(diǎn)，具有TaPod-A1b等位變異類型品種(系)的POD活性(2 595.3 U/(g·min))極顯著(P<0.01)高于具有TaPod-A1a等位變異類型品種(系)(2 346.0 U/(g·min))，TaPod-A1b為優(yōu)異等位變異，在新疆冬小麥麥引進(jìn)品種(系)和新疆春小麥早期品種(系)中2個(gè)等位變異類型的材料間POD活性均具有極顯著差異(P<0.01)；在TaPod-D1位點(diǎn)，具有TaPod-D1b等位變異類型品種(系)的POD活性(2 503.9 U/(g·min))顯著(P<0.05)高于具有TaPod-D1a等位變異類型品種(系)(2 376.9 U/(g·min))，在新疆冬小麥品種(系)中2個(gè)等位變異類型的材料間POD活性具有顯著差異(P<0.05)。TaPod-A1位點(diǎn)檢測(cè)與魏景欣[3]一致，可用于新疆小麥POD活性的輔助選擇，而TaPod-D1位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果顯示TaPod-D1b為優(yōu)異等位變異。表3

表3 不同類型小麥材料不同等位變異的POD活性

2.3 TaPod-A1和TaPod-D1位點(diǎn)等位變異組合與POD活性的關(guān)系

在檢測(cè)的113份新疆小麥材料中，TaPod-A1和TaPod-D1基因位點(diǎn)共存在TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1a/TaPod-D1b、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b四種等位變異組合類型。不同組合類型的總體分布比例表現(xiàn)不同。研究表明，2個(gè)高POD活性等位變異組合TaPod-A1b/TaPod-D1b(活性為2 706.2 U/(g·min))顯著高于由2個(gè)低POD活性的等位變異組合TaPod-A1a/TaPod-D1a(2 283.6 U/(g·min))，由一個(gè)高POD活性和一個(gè)低POD活性等位變異組合的TaPod-A1a/TaPod-D1b(2 408.4 U/(g·min))和TaPod-A1b/TaPod-D1a(2 516.8 U/(g·min))POD活性無(wú)顯著差異。將2個(gè)功能標(biāo)記組合使用，可以提高優(yōu)異等位基因的選擇效率。表4

表4 2個(gè)基因不同等位變異的POD活性

2.4 不同類型春小麥品種(系)中 TaPod-A1 和 TaPod-D1位點(diǎn)等位變異的分布頻率

研究表明，在TaPod-A1位點(diǎn)，新疆春小麥品種(系)中具有TaPod-A1b變異類型的材料有17份(占70.8%)，為優(yōu)勢(shì)等位變異，其中早期品種(系)和近期品種(系)TaPod-A1b分布頻率分別為75.0%和70.0%，在TaPod-D1位點(diǎn)，具有TaPod-D1a在新疆春小麥品種(系)資源中有20份(83.3%)，為優(yōu)勢(shì)等位變異，其中早期品種(系)和近期品種(系)TaPod-D1a分布頻率分別為100.0%和80.0%，無(wú)論是從新疆春小麥品種(系)的總體還是從早期或近期來(lái)看，均表現(xiàn)出TaPod-A1b和TaPod-D1a為優(yōu)勢(shì)等位變異。在24份新疆春小麥材料中共有TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b3種等位變異，TaPod-A1b/TaPod-D1a在24份新疆小麥品種(系)、早期品種(系)或近期品種(系)分布頻率分別為54.2%、75.0%和50.0%，均表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)等位變異。表5

表5 不同類型新疆春小麥材料不同等位變異的頻率

3 討 論

3.1 POD活性的測(cè)定

研究表明，新疆推廣種植的小麥品種(系)POD活性高，品種(系)間活性變異范圍大，其POD活性總體要高于全國(guó)3個(gè)主產(chǎn)麥區(qū)(北部冬麥區(qū)、黃淮麥區(qū)和長(zhǎng)江流域與西南麥區(qū))推廣的品種(系)[3]。從不同生產(chǎn)麥區(qū)來(lái)看，新疆小麥籽粒POD活性最低略高于中國(guó)北部冬麥區(qū)小麥品種(系)(729.36 U/(g·min))的活性，最高是長(zhǎng)江流域與西南麥區(qū)的小麥品種(系)(653.38 U/(g·min))的7倍。主要是由氣候條件的差異造成的，新疆的干旱半干旱地區(qū)，年降雨量平均為117.8 mm，是我國(guó)典型的干旱少雨地區(qū)，還有諸如鹽漬化和高溫等非生物逆境脅迫，更易引起品種(系)的POD活性增高[23-26]。相比于其他麥區(qū)，新疆小麥品種(系)與中國(guó)北部冬麥區(qū)的小麥品種(系)籽粒POD活性最為接近，這主要是由于北部冬麥區(qū)與新疆緯度相近，寒、旱等自然條件也更為相近[27-28]。從新疆不同類型小麥的POD活性來(lái)看，新疆春小麥POD平均活性(2 507.8 U/(g·min))高于新疆冬小麥的POD平均活性(2 417.2 U/(g·min))。相吉山等[29]和桑偉等[30]通過(guò)對(duì)新疆小麥品種(系)資源籽粒性狀和磨粉品質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)新疆春小麥品種(系)的蛋白質(zhì)含量往往比冬小麥高，作為籽粒蛋白質(zhì)組成部分的POD含量也相應(yīng)提高[31]，從而導(dǎo)致春小麥POD活性的偏高[32]，因此，新疆春小麥品種(系)有助于高POD活性品種(系)的遺傳改良。在新疆冬小麥品種(系)中，引進(jìn)品種(系)POD活性顯著高于自育品種(系)和地方品種(系)，因此,引進(jìn)品種(系)是新疆小麥面粉品質(zhì)遺傳改良的重要途徑，在新疆小麥育種工作中應(yīng)通過(guò)積極引進(jìn)外地品種(系)，來(lái)改善新疆小麥的面粉品質(zhì)。在新疆春小麥中，近期品種(系)POD活性高于早期品種(系)，除了消費(fèi)者對(duì)小麥品質(zhì)越來(lái)越高的關(guān)注和需求之外[33]，也源于新疆小麥育種近年來(lái)比較注重對(duì)面粉色澤的選擇[34-35]，使有利于提高小麥面粉白度的高POD活性基因得以在近期品種(系)中被保留。

3.2 POD活性相關(guān)基因TaPod-A1和TaPod-D1分子檢測(cè)結(jié)果

新疆小麥品種(系)在TaPod-A1和TaPod-D1 2基因位點(diǎn)，均以含有低POD活性相關(guān)的TaPod-A1a(63.7%)和TaPod-D1a(53.1%)的等位變異類型為主，這2種等位變異類型在均高于新疆小麥品種(系)中的分布頻率高于全國(guó)冬小麥品種(系)。而與高POD活性相關(guān)的優(yōu)異等位變異組合TaPod-A1b/TaPod-D1b在新疆冬、春小麥品種(系)中分布頻率均較低，分別只有14.6%和15.0%。趙廣才等[36]研究表明，我國(guó)小麥品質(zhì)研究起步較晚，前期更多的關(guān)注于產(chǎn)量性狀，忽視了品質(zhì)的遺傳改良，而品質(zhì)與產(chǎn)量存在一定負(fù)相關(guān)[37]，在進(jìn)行高產(chǎn)選擇的同時(shí)，不經(jīng)意間使非優(yōu)異等位變異類型在選育過(guò)程中得到了積累。優(yōu)異等位變異組合TaPod-A1b/TaPod-D1b在新疆冬小麥材料分布頻率大小為引進(jìn)品種(系)>自育品種(系)>地方品種(系)，而在新疆春小麥材料中的分布頻率為近期品種(系)>早期品種(系)。表明新疆地方品種(系)對(duì)新疆小麥的早期育種工作有較大影響，外來(lái)種質(zhì)的引入使得小麥優(yōu)異等位變異頻率得到提升；與此同時(shí)，近期品種和自育品種多為以地方品種或自育品種(系)和外引品種為親本所育，外來(lái)種質(zhì)的引入有力地推進(jìn)了小麥品質(zhì)的遺傳改良。因此，在今后育種工作中，應(yīng)積極引進(jìn)國(guó)內(nèi)外優(yōu)質(zhì)品質(zhì)(系)，采用優(yōu)異等位變異類型品種(系)為親本，對(duì)于提高新疆小麥品種(系)優(yōu)異等位變異的頻率，進(jìn)而加快新疆小麥品質(zhì)的遺傳改良是可行的。

3.3 POD活性相關(guān)分子標(biāo)記的實(shí)用性

功能標(biāo)記以其準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)單的特點(diǎn)而大規(guī)模應(yīng)用于作物育種[38]，功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用逐漸稱為小麥分子育種的重要研究?jī)?nèi)容[39]。魏景欣等[3]和時(shí)佳等[18]研究表明，TaPod-D1b和TaPod-A1a基因型與低POD活性相關(guān)，TaPod-D1a和TaPod-A1b基因型與高POD活性相關(guān)。研究用TaPod-A1和TaPod-D1小麥POD活性基因的功能標(biāo)記對(duì)新疆小麥品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TaPod-A1等位變異和TaPod-D1均與POD活性呈極顯著正相關(guān)，其中具有TaPod-A1b等位變異材料的POD活性顯著高于具有TaPod-A1a等位變異的材料，具有TaPod-D1b等位變異材料的POD活性顯著高于具有TaPod-D1a等位變異的材料。時(shí)佳等[18]利用TaPod-7D1和TaPod-7D6標(biāo)記對(duì)243份中國(guó)小麥材料進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)合POD活性表型數(shù)據(jù)分析，卻發(fā)現(xiàn)具TaPod-D1a等位變異的材料具有更高的POD活性，研究結(jié)果與其研究結(jié)果不一致，主要原因是POD的活性受遺傳因子、生態(tài)環(huán)境和栽培措施等影響[15]，李鳳梅等[40]研究表明，微效基因以及環(huán)境和其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑影響甜瓜性型；曹雪蓮等[41]發(fā)現(xiàn)基因間的互作及其與環(huán)境的互作對(duì)于小麥的抗穗發(fā)芽的影響較大；時(shí)佳等[42]通過(guò)產(chǎn)量功能標(biāo)記檢測(cè)時(shí)，也發(fā)現(xiàn)同一功能標(biāo)記會(huì)因?yàn)榄h(huán)境及材料不同等原因，造成同一功能標(biāo)記在不同研究中出現(xiàn)沒(méi)有顯著差異甚至結(jié)果相反的現(xiàn)象。因此，在今后的工作中可通過(guò)擴(kuò)大樣本量、提高樣本的遺傳多樣性，對(duì)TaPod-D1位點(diǎn)不同等位變異與POD活性相關(guān)性進(jìn)行深入研究，將基于TaPod-D1基因開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記應(yīng)用育種實(shí)踐。

4 結(jié) 論

在新疆小麥品種(系)材料中，以2個(gè)低POD活性等位變異類型TaPod-A1a和TaPod-D1a為主，且2個(gè)高POD活性等位變異類型TaPod-A1b/TaPod-D1b所占比例較少。TaPod-A1的功能標(biāo)記POD-3A1和POD-3A2能較好的區(qū)分小麥籽粒POD活性的高低，可用于POD活性的分子標(biāo)記輔助選擇。TaPod-D1功能標(biāo)記POD-7D1和POD-7D6標(biāo)記結(jié)果與POD活性測(cè)定結(jié)果相對(duì)于前人TaPod-D1a為高POD活性等位變異的結(jié)論不一致，該標(biāo)記仍需擴(kuò)大材料做進(jìn)一步驗(yàn)證。將2個(gè)功能標(biāo)記組合使用，能更有效地篩選出高POD活性材料。