6種酶抑制-比色法快速檢測試劑盒對4種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性

羅俊霞， 趙建波， 張 剛， 尚航影， 張 威， 馬 蕾， 郭華婷， 劉 佳， 張全智

(1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心， 河南 鄭州 450006； 2.鄭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 河南 鄭州 450006； 3.河南恒晟檢測技術(shù)有限公司,河南 新鄭 451100； 4.三門峽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心, 河南 三門峽 472000； 5.新鄭市農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心， 河南 新鄭 451100)

隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高，食品安全問題越來越受人們的重視，特別是在中國加入WTO后，食品安全問題受到全球的關(guān)注。于是，農(nóng)業(yè)部從2001年4月啟動無公害食品行動計劃，率先在北京、天津、上海和深圳4個城市進(jìn)行試點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上，于2002年7月開始在全國范圍內(nèi)全面推進(jìn)“無公害食品行動計劃”。各級農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測機(jī)構(gòu)紛紛成立，有關(guān)農(nóng)產(chǎn)品安全檢測的研究陸續(xù)開展。酶抑制-比色法快速檢測農(nóng)藥殘留的方法是現(xiàn)有的農(nóng)藥殘留檢測方法之一[1]，是利用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性這一毒理學(xué)反應(yīng)，在酶反應(yīng)試驗(yàn)中加入底物和顯色劑，通過紫外-分光光度計在410 nm的波長下進(jìn)行比色，根據(jù)吸光度值的變化計算膽堿酯酶的抑制率，從而判斷農(nóng)藥殘留是否存在[2]。目前，有很多學(xué)者紛紛對來源于動物或者植物的酶進(jìn)行篩選和研究[3-7]，對商品化酶抑制-比色法快速檢測試劑盒的評價和其對農(nóng)藥的敏感性測定的研究較少。據(jù)不完全調(diào)查，應(yīng)用于商品化酶抑制-比色法快速檢測試劑盒生產(chǎn)的酶多來源于動物酯酶，由于不同來源的酶對同一農(nóng)藥的敏感性不同，導(dǎo)致不同的商品化酶抑制-比色法試劑盒對同一種農(nóng)藥的檢出限不一樣[8-12]，所以在實(shí)際工作中檢測相同的樣品使用不同的試劑盒進(jìn)行測定結(jié)果有較大差異。同時，因?yàn)楝F(xiàn)有農(nóng)藥種類繁多，商品試劑盒中未對該敏感農(nóng)藥及其檢出限進(jìn)行說明，為了解不同品牌酶抑制-比色法試劑盒對在生產(chǎn)中使用較多的甲胺磷、毒死蜱、甲基對硫磷、三唑磷4種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性，對6種商品化酶抑制-比色法快速檢測試劑盒的敏感性進(jìn)行測定，以期為商品化酶抑制-比色法快速檢測農(nóng)藥殘留的試劑盒的選擇和使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)盒 酶抑制-比色法快速檢測農(nóng)藥殘留試劑盒：深圳市A試劑盒、廣州B試劑盒、廣東C試劑盒、廈門D試劑盒、湖北E試劑盒、深圳F試劑盒，以下簡稱試劑盒A、B、C、E、D、F。

1.1.2 儀器 CL-BⅢ型16通道的農(nóng)殘速測儀，上海復(fù)博農(nóng)業(yè)科技有限公司；SHA-C型雙重恒溫水浴振蕩器，杰瑞爾電器有限公司；HH.W21-Cr 420型電熱恒溫水浴鍋，北京三二八科學(xué)儀器有限公司；WH-861型漩渦混合器，上海精密儀器儀表有限公司；Rongtai 5 mL和Thermo 200 μL的移液槍；

1.1.3 試劑 1 000 mg/L的甲胺磷、毒死蜱、甲基對硫磷、三唑磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，由農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研檢測所生產(chǎn)。使用時按需稀釋成80 μg/mL的儲備液。

1.2 方法

1.2.1 試劑的配制 各品牌的農(nóng)藥殘留檢測試劑盒里有緩沖試劑、酶試劑、顯色劑和底物，在每次使用前，緩沖試劑用500 mL的蒸餾水溶解，酶試劑、顯色劑和底物分別按各試劑盒說明書的要求進(jìn)行配制；具體見表1。

表1 6種酶抑制-比色法試劑盒中各種試劑的配制方法Table 1 Preparation methods of six kinds of reagents in enzyme inhibition colorimetric assay kit

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計 在農(nóng)藥的測定中，農(nóng)藥濃度是影響測定結(jié)果的關(guān)鍵因素、測定時取用的提取液體積也對測定結(jié)果稍有影響。因此，試驗(yàn)在測定時需考慮檢測農(nóng)藥的濃度及提取液體積。測定時取用1.1.3中的農(nóng)藥貯備液按2 g的稱樣量制備成濃度為0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg的甲胺磷、毒死蜱 、甲基對硫磷和三唑磷，各濃度設(shè)置3次重復(fù)；根據(jù)緩沖溶液或樣品提取液的取用體積，針對各農(nóng)藥的不同濃度設(shè)置2個處理，即取用提取液3 mL和2.5 mL，分別采用6種酶抑制-比色法試劑盒(以下簡稱6種試劑盒)進(jìn)行測定。

1.2.3 對照液的測試 分別移取緩沖溶液3 mL和2.5 mL于10 mL試管中，依次往提取液中加入0.1 mL的酶液、0.1 mL的顯色劑，用旋渦混合振蕩器混勻，再用電熱恒溫水浴鍋在37℃下水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物搖勻，立即放入CL-BⅢ型16通道的農(nóng)殘速測儀儀器比色池中進(jìn)行測定，記錄ΔA值。

1.2.4 樣品處理 參照國標(biāo)[13]進(jìn)行。往制備好的模擬樣品中加入10 mL緩沖液后移取3 mL或者2.5 mL的試管中，按照1.2.3的流程操作，并記錄ΔA值(測試每一組樣品時加一個對照)。

1.3 6種試劑盒對4種農(nóng)藥測定結(jié)果的差異

1.3.1 6種試劑盒的精密度及重現(xiàn)性測定 根據(jù)每個處理的3次測定值計算出變異系數(shù)，考查每種試劑盒在檢測過程中的精密度和測試樣品的重現(xiàn)性。

1.3.2 6種試劑盒對4種農(nóng)藥的敏感性測定 根據(jù)不同濃度農(nóng)藥的抑制率平均值繪制抑制率對濃度的折線圖，考查比較6種試劑盒中的酶對各種農(nóng)藥的敏感性。

1.3.3 6種試劑盒對4種農(nóng)藥的半抑制濃度IC50及線性范圍測定 參照劉洋等[3-7,9,11-12,14-18]的方法對各品牌試劑盒測定各農(nóng)藥的3次測定結(jié)果，選取抑制率在100%以下的濃度值，計算抑制率對農(nóng)藥濃度常用對數(shù)的線性回歸方程為抑制率方程、線性系數(shù)及每一種農(nóng)藥對各種試劑盒的半抑制濃度(IC50)。IC50的計算根據(jù)抑制率方程的Y=50%也就是抑制率為50%時，計算出相對應(yīng)的X軸的值，由此計算出相對應(yīng)的濃度；線性范圍是抑制率為0到測定的最大的抑制率對應(yīng)的濃度值之間。

1.3.4 6種試劑盒對4種農(nóng)藥的靈敏度測定 試驗(yàn)設(shè)定抑制率為10%時為試劑盒測定各農(nóng)藥的檢測限，根據(jù)抑制率方程計算當(dāng)抑制率為10%各種農(nóng)藥相對應(yīng)的濃度，記為IC10。

1.3.5 不同提取液的測定結(jié)果比較 通過1.3.1～1.3.3的結(jié)果比較3 mL和2.5 mL樣品提取體積對測定結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種試劑盒測定樣品的重現(xiàn)性

由表2可知，6種試劑盒測定農(nóng)藥的重現(xiàn)性在所使用的玻璃器皿清洗較好的情況下都比較好，不同提取液用量對6種試劑盒的相對偏差無影響。相對來說，除抑制率為0的情況，對于同種試劑盒測定同一種農(nóng)藥，抑制率越高其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差越小。如C、D、E試劑盒測定4種農(nóng)藥的抑制率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差基本上隨著農(nóng)藥濃度和抑制率的增高相對標(biāo)準(zhǔn)偏差降低。

表2 6種試劑盒測定不同濃度4種農(nóng)藥的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Determination of relative standard deviations of four pesticides with different concentrations by six kits %

2.2 6種試劑盒對4種農(nóng)藥的敏感性

從圖1可知，6種試劑盒對甲胺磷、毒死蜱、甲基對硫磷和三唑磷4種農(nóng)藥的敏感性。

2.2.1 甲胺磷 E試劑盒測定甲胺磷出現(xiàn)異常，提取液體積為3 mL和2.5 mL均表現(xiàn)為在甲胺磷濃度為1 mg/kg時抑制率最大，分別為14%和9.4%，甲胺磷濃度為2 mg/kg時抑制率降為0，甲胺磷濃度為3mg/kg時抑制率略有升高。當(dāng)甲胺磷濃度為0.05 mg/kg時，B、C、D、F試劑盒測定甲胺磷的抑制率差別不大，但隨著甲胺磷濃度的升高，抑制率也隨著升高，在0.05～3mg/kg，抑制率的增高幅度為D>C>B>F 。

2.2.2 毒死蜱 A試劑盒在測定毒死蜱時出現(xiàn)異常而且抑制率相對較低，基本呈平行于橫軸的直線；當(dāng)毒死蜱濃度為0.05 mg/kg時，D和C試劑盒測定毒死蜱的抑制率差別不大，E、F、B試劑盒測定毒死蜱的抑制率差別也不大，但是D、C和E、F、B間存在較大差異：C試劑盒測定毒死蜱的濃度為0.05 mg/kg時，3 mL和2.5 mL樣品提取液的抑制率分別為50.8%和39.2%，之后急劇上升，當(dāng)濃度為0.5 mg/kg抑制率均達(dá)100%；D試劑盒測定毒死蜱的濃度為0.05 mg/kg時，3 mL和2.5 mL樣品提取液的抑制率分別為65.4%和58%，之后緩慢上升；當(dāng)毒死蜱濃度為3 mg/kg，其抑制率分別達(dá)82.5%和78.7%。當(dāng)樣品提取液為3 mL，毒死蜱濃度為0.05～3 mg/kg時，B、E、F試劑盒的抑制率增高幅度分別為36.6%、28.4%和35.3%；當(dāng)樣品提取液取用2.5 mL時，B和F試劑盒在毒死蜱濃度為0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg的抑制率均為0，在毒死蜱濃度為2～3 mg/kg，抑制率稍有增高；毒死蜱濃度為0.05～3 mg/kg，E試劑盒的抑制率在8.4%～38.6%。

2.2.3 甲基對硫磷 B、C、F試劑盒對甲基對硫磷不敏感，甲基對硫磷濃度在3 mg/kg以下的抑制率均為0，A試劑盒測定甲基對硫磷的抑制率無規(guī)律性，D、E試劑盒測定甲基對硫磷在其濃度為0.5 mg/kg時抑制率為0或接近0，隨著甲基對硫磷濃度的升高抑制率呈不同幅度的增長，但增長的幅度較小。

2.2.4 三唑磷 B試劑盒測定對三唑磷不敏感，三唑磷濃度在3 mg/kg以下的抑制率均為0；同毒死蜱一樣，A試劑盒在測定三唑磷時出現(xiàn)異常，隨著農(nóng)藥濃度的變化抑制率變化沒有規(guī)律，基本呈平行于橫軸的直線；C、D、E、F試劑盒測定三唑磷時隨著三唑磷濃度的升高，其抑制率呈不同幅度的增長，當(dāng)樣品提取液為3 mL，三唑磷濃度為0.05～3 mg/kg時，其抑制率的增高幅度分別為73.3%、56.5%、81%和19.9%；當(dāng)樣品提取液為2.5 mL時，其抑制率的增高幅度分別為65.7%、43.8%、72.9%、19%?？傮w而言C、D、E、F試劑盒在提取液為3mL的抑制率略高于提取液為2.5mL的抑制率。

2.3 6種試劑盒測定4種農(nóng)藥的抑制率和農(nóng)藥濃度的相關(guān)性及敏感性

從表3可知6種試劑盒測定甲胺磷、毒死蜱、甲基對硫磷和三唑磷4種農(nóng)藥的抑制率與農(nóng)藥濃度的相關(guān)性及敏感性。

表3 6種試劑盒測定4種農(nóng)藥的抑制率和農(nóng)藥濃度的相關(guān)性、檢出限及敏感性Table 3 Correlation, detection limit and sensitivity between inhibition rate and pesticide concentration of four pesticides determined by six kits mg/kg

2.3.1 甲胺磷 6種試劑盒中，除E和F外，A、B、C、D試劑盒測定甲胺磷的抑制率和農(nóng)藥濃度之間呈較好的線性關(guān)系，3 mL的樣品提取液時，A、B、C、D試劑盒的抑制率和甲胺磷農(nóng)藥濃度的相關(guān)系數(shù)分別為0.776、0.881 4、0.710 4和0.981 5；2.5 mL的樣品提取液時，B、C、D的抑制率與甲胺磷農(nóng)藥濃度的相關(guān)系數(shù)分別為1、0.932 7和0.993；從IC10看，6種試劑盒對甲胺磷的敏感性為D>A>C>B；同時各試劑盒對甲胺磷的敏感性在樣品提取液用量為3 mL和2.5 mL間有一定的差異，在樣品提取液用量為3 mL和2.5 mL時，A、B、C、D試劑盒的IC10分別為0.0824 3 mg/kg、1.622 9 mg/kg、 1.199 6 mg/kg、0.047 57 mg/kg和2.364 8 mg/kg、0.792 9 mg/kg、0.068 27 mg/kg。

從半抑制濃度(IC50)看，在樣品提取液用量為3 mL和2.5 mL時，除D試劑盒測定甲胺磷的半抑制濃度為0.480 8 mg/kg和0.647 6 mg/kg外，A、B、C試劑盒測定甲胺磷的半抑制濃度均大于3 mg/kg。

2.3.2 毒死蜱 除A試劑盒外，其他5種試劑盒測定毒死蜱的抑制率和農(nóng)藥濃度間呈較好的線性關(guān)系，3 mL的樣品提取液和2.5 mL的樣品提取液的毒死蜱抑制率和毒死蜱濃度的相關(guān)系數(shù)分別為0.925 4、1、0.805 5、0.809、0.631 2和0.971 5、1、0.912 2、0.765 9、0.966 6；從IC10看，3 mL和2.5 mL的樣品提取液取進(jìn)行測定，5種試劑盒對毒死蜱的敏感性均為D>C>E>B>F，且各試劑盒間存在較大差異，如C和D間存在數(shù)量級上的差異；各試劑盒對毒死蜱的敏感性3 mL和2.5 mL的樣品提取液取用量測定存在較大差異，如D試劑盒3 mL和2.5 mL的樣品提取液計算的IC10結(jié)果存在數(shù)量級上的差異。

從半抑制濃度(IC50)看，在樣品提取液用量為3 mL和2.5 mL時，除D和C試劑盒測定毒死蜱的半抑制濃度為1.2365×10-3mg/kg、0.048 16 mg/kg和0.011 84 mg/kg、0.075 27 mg/kg外，B、E、F試劑盒測定甲胺磷的半抑制濃度均大于6 mg/kg。

2.3.3 甲基對硫磷 6種試劑盒中A、B、C測定甲基對硫磷分抑制率和農(nóng)藥濃度間無線性關(guān)系，F(xiàn)試劑盒對甲基對硫磷不敏感， 3 mL和2.5 mL的樣品提取液，在5個濃度水平下抑制率均為0。從IC10看，D和E對甲基對硫磷的敏感性在樣品提取液用量為3 mL時，為D>E，在提取液用量為2.5 mL時，為E>D。

從半抑制濃度(IC50)看，僅D和E試劑盒測定甲基對硫磷的半抑制濃度均大于10 mg/kg。

2.3.4 三唑磷 6種試劑盒中A試劑盒測定三唑磷抑制率和農(nóng)藥濃度間無線性關(guān)系；B試劑盒對三唑磷不敏感， 3 mL和2.5 mL的樣品提取液，在5個濃度水平下抑制率均為0；C、D、E、F試劑盒測定三唑磷的抑制率和農(nóng)藥濃度間均存在較好的線性關(guān)系，在樣品提取液用量為3 mL和2.5 mL時，C、D、E、F試劑盒測定的抑制率和三唑磷濃度的相關(guān)系數(shù)分別為0.858、0.812 4、0.867 5、0.683 2和0.835 2、0.901 4、0.843 5、0.607 5；從IC10看，在樣品提取液取用量為3 mL和2.5 mL時，C、D、E、F試劑盒對三唑磷的敏感性性均為C>E>D>F，各試劑盒對三唑磷的敏感性在3 mL和2.5 mL的樣品提取液取用量間差異較小。

但是從半抑制濃度(IC50)看，C和E試劑盒測定三唑磷的半抑制濃度較低，在樣品提取液用量為3 mL和2.5 mL時，其半抑制濃度分別為0.883 7 mg/kg、0.960 3 mg/kg和1.449 1 mg/kg、1.369 6 mg/kg外，D、F試劑盒測定三唑磷，在樣品提取液取用量為3 mL和2.5 mL時的半抑制濃度均大于3 mg/kg。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明， 6種試劑盒對4種農(nóng)藥的靈敏度均不同，測試時取用3 mL的提取液和取用2.5 mL的提取液根據(jù)農(nóng)藥的不同和試劑盒的不同存在一定差異。6種試劑盒測定甲胺磷、毒死蜱、甲基對硫磷、和三唑磷的半抑制濃度均大于3 mg/kg，大于國家限量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定(甲胺磷0.1 mg/kg、毒死蜱1 mg/kg、甲基對硫磷0.02 mg/kg、三唑磷0.1 mg/kg)，建議在實(shí)際的檢測工作中對抑制率≥10%的樣品進(jìn)行復(fù)檢，同時上色譜質(zhì)譜進(jìn)行定性定量。

6種試劑盒對4種農(nóng)藥的敏感性均不相同，這可能是跟各試劑盒所選用的酶的來源不同有關(guān)，也可能跟各試劑盒中所選用的酶的提取的方法或者酶的純度不同有關(guān)系。從IC50看，多數(shù)試劑盒測定甲胺磷、毒死蜱、甲基對硫磷和三唑磷的半抑制濃度均大于3 mg/kg，和國家限量標(biāo)準(zhǔn)[19]進(jìn)行比較，多數(shù)酶抑制法快速檢測試劑盒測定甲基對硫磷、三唑磷和甲胺磷已經(jīng)失去意義。在日常檢測工作中，由于待測樣品中不僅農(nóng)藥的品種未知，農(nóng)藥的含量也未知，根據(jù)各試劑盒測定4種農(nóng)藥的檢出限看，多數(shù)試劑盒測定4種農(nóng)藥的檢出限(IC10)已超過國家標(biāo)準(zhǔn)，故建議在用商品化酶抑制-比色法快速檢測試劑盒進(jìn)行果蔬中農(nóng)藥殘留的篩查時對于抑制率大于10%的樣品進(jìn)行復(fù)檢，同時借助色譜及質(zhì)譜進(jìn)行定性定量分析。

有學(xué)者認(rèn)為酶試劑易失活，導(dǎo)致反應(yīng)不穩(wěn)定，檢測結(jié)果誤差較大，重復(fù)性不好，實(shí)際應(yīng)用中的確認(rèn)率僅為60%～70%，僅適用于現(xiàn)場定性和半定量檢測[20]，而筆者認(rèn)為,酶試劑容易失活是因?yàn)槭芡饨绲挠绊戄^大，因?yàn)槠鋵τ行┺r(nóng)藥極為敏感，比如有些酶對敵敵畏、敵百蟲[11]和毒死蜱等農(nóng)藥的敏感性極強(qiáng)，空氣中的這些農(nóng)藥分子都有可能導(dǎo)致酶失去活性，但是商品化快速檢測試劑盒中的酶試劑的穩(wěn)定性還是比較好的，配制好的酶在合適的溫度條件下存放較長的時間依然具有活性[9-11]，而且酶抑制-比色法快速檢測農(nóng)藥殘留的方法是一種非定性也非定量的方法[18]。國家標(biāo)準(zhǔn)[13]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[21]中對于酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留的方法的超標(biāo)樣品的判定設(shè)置了不同的標(biāo)準(zhǔn)，分別為≥50%或≥70%為超標(biāo)樣品，如果樣品中含有甲胺磷和甲基對硫磷等國家禁用的農(nóng)藥，即使抑制率小于50%或70%，按國家限量[19]標(biāo)準(zhǔn)判定，該樣品依然為不合格樣品。盡管酶抑制-比色法快速檢測技術(shù)已經(jīng)成為國內(nèi)外快速檢測農(nóng)藥殘留的主流技術(shù)，也是現(xiàn)階段比較合理的選擇方案之一[2]，但筆者認(rèn)為該技術(shù)是否合理還有待于廣大科研工作者進(jìn)一步研究。