光照節(jié)律及強度對黑水虻成蟲行為及繁殖能力的影響

◆作者：周海泳阮明君李楚君陳柏宇李浩倫李昌鵬朱劍鋒張 蕓胡文鋒＊

◆單位：1.深圳市海量農(nóng)產(chǎn)品投資有限公司；2.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院；3.廣州無兩生物科技有限公司；4.生物源生物技術(shù)（深圳）股份有限公司；5.中山大學生命科學學院

黑水虻，也稱為亮斑扁角水虻（Hermetia Illucens L.），是一種雙翅目水虻科的昆蟲，起源于南美洲。在我國，黑水虻主要分布在廣東、廣西、海南、云南、福建、湖南和湖北等地區(qū)（安新城等，2007）。黑水虻具有繁殖能力強，轉(zhuǎn)化率高等特點，能分解禽畜糞便、餐廚垃圾及動物尸體等有機垃圾（BONDARI等，1987）；其幼蟲含豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，可用于開發(fā)飼料蛋白、飼料油脂（李天昊等，2017），具有廣闊的市場前景和社會效益。目前，國內(nèi)外對黑水虻的研究主要在黑水虻養(yǎng)殖、有機垃圾的生物降解及資源化利用方面，關(guān)于光照對黑水虻成蟲繁殖影響的內(nèi)容較少。

光照是昆蟲賴以生存的重要因素，大部分昆蟲都具有趨光性。趨光性是昆蟲通過視覺器官中的感光細胞對特定范圍內(nèi)的光譜產(chǎn)生感應，并做出定向活動的現(xiàn)象。趨光性對采食、交配和產(chǎn)卵等活動起到重要作用（邊磊等，2012）。研究表明，黑水虻成蟲的繁殖行為受光照影響，不同光照環(huán)境下活躍度也不同（Holmes等，2017）。白天光照強度與其交配活躍度顯著相關(guān)，當陽光強度低于63μmol/(m2·s)，黑水虻的繁殖活躍度較低，甚至沒有進行交配；當光照強度達到200μmol/（m2·s）時，75%成蟲會進行交配，而在冬季正午陽光充足的時段，黑水虻成蟲的活躍度及繁殖情況明顯加；黃苓等（2008）指出，當陽光光照強度7800 lux以上時，成蟲活躍度高并進行產(chǎn)卵行為。

節(jié)律常常對昆蟲的生理和行為造成很大的影響，如孵化、羽化、交配、產(chǎn)卵等。Qiu等（1996）發(fā)現(xiàn)，改變光照周期會導致Period基因的mRNA表達相位發(fā)生變化，短光照周期條件下（8 h光照∶16 h黑暗），Period基因的mRNA峰值提前；長光照周期條件下（16 h光照∶8 h黑暗），Period基因的mRNA峰值推遲，進而改變果蠅的晝夜節(jié)律。黑水虻成蟲的繁殖活動也具有生物節(jié)律，太陽光下照射，交配主要集中在上午時段（黃苓，2008）；Kim等（2008）發(fā)現(xiàn)，黑水虻成蟲在羽化后第2天開始交配，并在第3天活躍性最高，且交配行為主要發(fā)生在10:00～16:00，因為這一時間段光照強度總體最大。

光照強度和節(jié)律影響黑水虻成蟲的交配情況及產(chǎn)卵量。目前，黑水虻繁殖生產(chǎn)主要通過太陽光對其交配產(chǎn)卵進行補光促進（Tomberlin等，2009）。自然條件下，太陽光照強度和節(jié)律缺乏穩(wěn)定性和均勻度，無法保障黑水虻蟲卵的穩(wěn)定供應?，F(xiàn)階段國內(nèi)外關(guān)于光照對黑水虻繁殖力影響的探究還比較少。鑒于此，本試驗旨在通過研究光照強度和光照節(jié)律等因素對黑水虻成蟲行為及繁殖能力的影響，用于促進黑水虻成蟲在黑暗條件下的活躍度及繁殖能力，從而為黑水虻成蟲繁殖提供參考，促進行業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑水虻蟲卵、蟲蛹、成蟲，均由廣州無兩生物科技有限公司提供。

試驗器材包括碘鎢燈，產(chǎn)卵板（15×5×2cm），養(yǎng)蟲籠（50cm3，25 cm3），電子溫度計，光照強度測量儀，攝像頭，電子稱，遮光布，一次性飯盒，小網(wǎng)袋，錐形瓶、溫濕度計、培養(yǎng)箱、烘箱、定時開關(guān)。

試驗開始前，在孵化室內(nèi)密切觀察蟲蛹，在成蟲破蛹（羽化）后24h內(nèi)分開雌雄飼養(yǎng)，蜂蜜水飼養(yǎng)一天，在48～72h內(nèi)完成挑選轉(zhuǎn)移（即實驗采用3日齡成蟲）。

1.2 不同光照強度對黑水虻成蟲飛行及交配行為的影響

將9個養(yǎng)蟲籠（25 cm3）分配在碘鎢燈的照射范圍內(nèi)，分成3組，每組3個養(yǎng)蟲籠。光照強度測量儀放在籠子里面測量光強，分成3000、500、110 lux三個光照強度，組內(nèi)籠子光照強度保持基本一致。在每個養(yǎng)蟲籠左側(cè)距離養(yǎng)蟲籠2 m處放置攝像頭。每個籠子中部氣溫相近，放入3日齡成蟲5對。碘鎢燈照射時間為9：00～18：00，同時打開錄像裝置。實驗進行3天，期間每8h噴一次水。在所得視頻中以每5min為一段按照平均時間間隔抽取5個視頻觀察統(tǒng)計黑水虻成蟲的飛行次數(shù)以及嘗試交尾次數(shù)。

飛行數(shù)指黑水虻成蟲離開籠子底部或側(cè)面，在空中飛行的數(shù)目（可以是同一成蟲多次飛行，也可是不同成蟲的飛行）；嘗試交尾數(shù)指雄蟲和雌蟲嘗試交尾的次數(shù)（每一對成蟲交尾記為1次），若成蟲在空中嘗試交尾，則記錄為交尾數(shù)，而不記錄為飛行數(shù)。

1.3 光照節(jié)律對黑水虻成蟲行為及繁殖能力的影響

1.3.1 光照節(jié)律對黑水虻成蟲活躍性的影響

將裝有定時開關(guān)的碘鎢燈置于養(yǎng)蟲籠（50 cm×50 cm×50 cm）正上方，對養(yǎng)蟲籠進行遮光處理，并確保每個養(yǎng)蟲籠所受光照強度相同。實驗設計5種光照節(jié)律（L表示光照的小時數(shù)；D表示遮光黑暗處理的小時數(shù)）：L:D=6L∶18D，L∶D=12L∶12D，L∶D=18L∶6D，L∶D=24L∶0D，L∶D∶L∶D=6L∶6D∶6L∶:6D。分別在五種養(yǎng)蟲籠中放入25對3日齡黑水虻成蟲，按照其光照節(jié)律開關(guān)碘鎢燈光源，利用攝像頭記錄成蟲飛行數(shù)和交尾數(shù)，持續(xù)觀察3天。實驗重復3次。

1.3.2 光照節(jié)律對黑水虻成蟲產(chǎn)卵的影響

稱取同一批次黑水虻蟲蛹50 g，分別在5個不同光照節(jié)律對應的養(yǎng)蟲籠中放入10 g蟲蛹和產(chǎn)卵板。待黑水虻羽化成蟲，按照養(yǎng)蟲籠不同的光照節(jié)律開關(guān)碘鎢燈光源，光照四天后，每天定期更換產(chǎn)卵板，收集成蟲所產(chǎn)蟲卵，記錄數(shù)據(jù)。實驗持續(xù)15天，至黑水虻成蟲死亡結(jié)束，統(tǒng)計每種養(yǎng)蟲籠中成蟲雄雌數(shù)目。實驗重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)用Excel整理試驗數(shù)據(jù)，SPSS 24.0進行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)在進行相應的統(tǒng)計分析前需要采用Shapiro-Wilk test檢驗變量是否符合正態(tài)分布規(guī)律，對于符合正態(tài)分布的變量可直接使用單因素方差分析進行差異性檢驗，并用Turkey's法進行多重比較，并進行方差同質(zhì)性檢驗。對于不符合正態(tài)分布的變量用非參數(shù)檢驗分析，結(jié)果用“平均值±標準誤”表示，并進行多重比較。P＜0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照強度碘鎢燈光照對黑水虻成蟲行為和繁殖能力的影響

由圖1可知，在同一時段，黑水虻成蟲的飛行次數(shù)和交尾次數(shù)隨著光照強度的減弱呈下降趨勢，且總體上差異顯著（P＜0.05）。光照強度為3000 lux時成蟲飛行數(shù)最大，為60.07±10.26，光照強度為110 lux時成蟲飛行數(shù)最小，為19.31±3.39，兩者差異顯著（P=0.001）。而光照強度500 lux時成蟲飛行次數(shù)為33.00±5.18，與上述兩組差異不顯著（P＞0.05）。黑水虻成蟲交尾數(shù)情況與飛行數(shù)情況相同，光照強度為3000 lux時成蟲交尾數(shù)最大，為13.93±2.64，光照強度為110 lux時成蟲交尾數(shù)最小，為3.29±0.87，兩者差異顯著（P=0.001）。而光照強度500 lux時成蟲交尾次數(shù)為6.36±1.38，上述兩組差異不顯著（P＞0.05）。

由圖2所示，在不同的時間段，黑水虻成蟲的活動程度不同，總體上黑水虻上午時間段比下午更加活躍，飛行次數(shù)以及嘗試交尾次數(shù)的分配在時間段上差異顯著（P＜0.001，P=0.002）。黑水虻在第一天上午的飛行次數(shù)（32.60±4.291）與第二天上午的飛行次數(shù)（28.82±3.611）差異不顯著（P＞0.05），二者均大于下午飛行次數(shù)（15.00±2.772），（P≤0.005）。第一天上午的嘗試交尾次數(shù)（6.93±1.171）與第二天上午嘗試交尾次數(shù)（4.69±0.763）差異不顯著（P＞0.05），二者均大于下午的嘗試交尾次數(shù)（2.7±0.643）（P≤0.005）。

在固定的光照強度和時間段下，開燈后每隔5 min記錄一次時間點。從圖3中可以看出，黑水虻的飛行次數(shù)以及嘗試交尾次數(shù)在所測的時間點上呈現(xiàn)依次遞減的趨勢，且兩者總體上均差異顯著（P＜0.001）。5 min時，黑水虻成蟲在飛行次數(shù)上最大（50.52±5.742），25 min時，飛行次數(shù)上最?。?1.33±3.711），（P＜0.001）。黑水虻的飛行次數(shù)各相鄰時間點之間差異不顯著（P＞0.05），其余組間比較差異顯著（P＜0.05）。同樣，在5 min時，黑水虻嘗試交尾次數(shù)上最大（11.78±1.520），20 min時，嘗試交尾次數(shù)最小（1.52±0.487），P＜0.001。黑水虻的嘗試交尾次數(shù)各相鄰時間點之間差異不顯著（P＞0.05），其余組間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 不同光照節(jié)律對黑水虻成蟲活動的影響分析

由圖4可知，光照節(jié)律分別為6L∶18D和12L∶12D的黑水虻成蟲飛行數(shù)最多，分別為29.83±6.58和29.50±8.67，光照節(jié)律為6L∶6D∶6L∶6D的最少，僅為13.00±2.27，但不同光照節(jié)律對黑水虻成蟲飛行次數(shù)的影響差異不顯著（P＞0.05）。而光照節(jié)律對于黑水虻成蟲交尾數(shù)的影響，光照節(jié)律6L∶18D的黑水虻成蟲交尾數(shù)最多，為20.83±4.90，光照節(jié)律18L:6D次之，為19.67±5.50，而光照節(jié)律6L∶:6D∶6L∶6D成蟲交尾數(shù)最少，僅為7.67±1.98，但不同光照節(jié)律對黑水虻成蟲交尾次數(shù)的影響差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 同一時段不同光照強度對黑水虻成蟲飛行次及交尾數(shù)的影響

圖2 時間段與黑水虻飛行次數(shù)及嘗試交尾次數(shù)關(guān)系圖

2.3 不同光照節(jié)律對黑水虻成蟲產(chǎn)卵的影響分析

該階段實驗考慮到每組重復實驗過程中可能受潛在環(huán)境因素的影響，且每組黑水虻成蟲雄雌比例不相等，根據(jù)每組黑水虻成蟲雄雌的實際對數(shù)，將產(chǎn)卵量按比例統(tǒng)一折算為50對黑水虻成蟲產(chǎn)卵量。由于試驗種群所在地自然光照節(jié)律一般為12L:12D，以光照節(jié)律12L∶12D組為基準，折算不同光照節(jié)律黑水虻成蟲的相對產(chǎn)卵量，利用成蟲相對產(chǎn)卵量進行對比分析。

由圖5可知，光照節(jié)律為12L∶12D的黑水虻成蟲相對產(chǎn)卵量最低，光照節(jié)律18L∶6D成蟲相對產(chǎn)卵量最大，為1.134±0.20，但各光照節(jié)律組間差異均不顯著（P＞0.05），說明光照節(jié)律對黑水虻成蟲產(chǎn)卵量影響不顯著。

圖3 時間與黑水虻飛行次數(shù)及嘗試交尾次數(shù)關(guān)系圖

圖4 不同光照節(jié)律對黑水虻成蟲飛行數(shù)及交尾數(shù)的影響

圖5 不同光照節(jié)律對黑水虻成蟲相對產(chǎn)卵量的影響

3 討論

3.1 不同光照強度碘鎢燈光照對黑水虻成蟲行為和繁殖能力的影響

本試驗采用羽化后24～48h內(nèi)的黑水虻成蟲，結(jié)果顯示，黑水虻的飛行次數(shù)及嘗試交尾次數(shù)出現(xiàn)隨著光強增大而上升的趨勢，且差異性顯著。得出結(jié)論，黑水虻成蟲的活躍度在高光強下要比低光強下高，與Tomberlin（2002）的研究結(jié)果一致。張光全（2007）表明，當光照強度為1～1500 lux時，小蠹雌成蟲的起飛量隨光照強度的增加而增加，且在1500 lux時起飛量達最大，而超過1500 lux時，起飛蟲量又逐漸減少；瓜實蠅成蟲在2400 lux下開始進行飛行活動，飛行的群體數(shù)量隨著光照強度的升高而增強，最適飛行活動的光照為9600 lux，但當光照強度高于12000 lux時，對其飛行行為有抑制作用，活躍成蟲的數(shù)量隨著光照強度的升高而降低（崔志富，2016）。

研究表明，陽光是影響交配的至關(guān)重要因素。太陽光照射下，黑水虻的日交配量可達70對以上（黃苓，2008）。本實驗是利用室內(nèi)燈光對黑水虻進行光照照射，且上午與下午的燈光環(huán)境一致。結(jié)果顯示，上午時段黑水虻的飛行次數(shù)及嘗試交尾次數(shù)比在下午時段更多更活躍，且主要集中在上午時段。黃苓等指出，85%的交配都發(fā)生在上午時段。早上8:30，當光照強度達到70μmol/（m2·s），黑水虻開始交配；140μmol/（m2·s）時，達交配高峰期；下午13:00之后，幾乎沒有出現(xiàn)交配現(xiàn)象，即使光強達到200μmol/（m2·s）。據(jù)此可推測，黑水虻成蟲的活躍度除了與光照強度有關(guān)，還與生物節(jié)律、生活習性等相關(guān)。

3.2 不同光照節(jié)律對黑水虻成蟲活動的影響分析

光照節(jié)律是昆蟲乃至多種生物用于預測季節(jié)及氣候變化的信號之一，在過往的研究中均有關(guān)于光照節(jié)律對昆蟲生理和行為的影響。涂小云等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，光照節(jié)律周期分別為14L∶10D、16L∶8D、18L∶6D、20L∶4D、22L∶2D時，對毛健夜蛾成蟲的總交配率或暗期交配率均有顯著性差異，而交配起始時間及高峰時段會隨斷光時間的延后而推后；韓桂彪等（2000）將棗粘蟲成蟲從光照周期為14L∶10D的環(huán)境中轉(zhuǎn)移至0L∶24D時，表現(xiàn)出明顯的生物節(jié)律，但將其轉(zhuǎn)移至24L∶0D的光周期環(huán)境時，其交配行為變得不活潑且不規(guī)則。

本試驗中用飛行數(shù)和嘗試交尾數(shù)作為黑水虻成蟲活躍程度的指標，此時黑水虻處于求偶交配階段，所以這些活躍程度的指標也部分反映了黑水虻交配階段受光照節(jié)律影響的情況。本實驗設置了5個光照節(jié)律組，最后實驗結(jié)果表明，各組飛行數(shù)和嘗試交尾數(shù)均差異不顯著。

本試驗中，黑水虻在上午時間段里的飛行數(shù)和嘗試交尾數(shù)比下午時間段更多，但同一時間段的不同光照節(jié)律活躍程度沒有顯著差異。推測黑水虻成蟲可能存在某些我們未知的生物機制，可以感受時間的變化，且對成蟲活躍程度的調(diào)控受光照節(jié)律的影響小，與果蠅體內(nèi)的miR-279可通過調(diào)節(jié)JAK／STAT途徑類似。黑水虻成蟲的生命周期較短（9～14天），為了能順利繁衍后代，可能存在另外一種生物機制，以克服生命周期短、求偶不成功等困難。而生物的活動是要消耗能量的，越活躍，消耗的能量就越多，更易死亡（Makkar等，2014）。根據(jù)試驗過程的粗略統(tǒng)計，不同光照節(jié)律組之間，成蟲的存活時間沒有明顯差異，即使是6L:18D組和24L:0D組，其每天成蟲死亡率與其他組也大致相同，推測與黑水虻成蟲的生命周期有關(guān)。Holmes等研究發(fā)現(xiàn)，光照時長顯著影響黑水虻幼蟲到羽化階段的生長發(fā)育。該研究設置了3個光照節(jié)律組：0L∶24D，8L∶16D，12L∶12D，所有幼蟲均能羽化，而12L:12D組所需時間最短；同時，比較從卵中孵化到成蟲的生命歷程所需時間，0L∶24D組需要的時間最長。結(jié)合本試驗的結(jié)果，推測光照節(jié)律對黑水虻的影響在成蟲階段之前比較顯著，而對成蟲影響差異不顯著。

3.3 不同光照節(jié)律對黑水虻成蟲產(chǎn)卵的影響分析

張方平等（2009）研究了光照節(jié)律對斑翅食蚧蚜小蜂的影響，結(jié)果表明，產(chǎn)卵量在長光照條件（16L:8D）時最多，短光照條件（10L:14D）時最少，差異顯著；湯玉清等（1993）研究了荔蝽卵平腹小蜂在5個光照節(jié)律（24L∶0D、18L∶6D、12L∶12D、6L∶18D和0L∶24D）下的日產(chǎn)卵情況，結(jié)果表明，在5個光照節(jié)律之間，平腹小蜂日產(chǎn)卵量沒有顯著差異，在無光照條件下也可以正常產(chǎn)卵，但在一天中不同時間的產(chǎn)卵數(shù)有顯著差異。本試驗的相對產(chǎn)卵量是以12L∶12D組的產(chǎn)卵量為基準1，將各組的總產(chǎn)卵量進行轉(zhuǎn)換得到各組間相對產(chǎn)卵量，雖然其他4組的相對產(chǎn)卵量大于1，但各組間差異不顯著。光照節(jié)律可能通過加速或延遲動物性腺的成熟，如縮短光照可誘發(fā)美洲紅點鮭性腺提前成熟，延長繁殖期（Peter等，1979），從而增加產(chǎn)卵量。有研究表明光照節(jié)律影響生殖細胞的輸送，如斜紋夜蛾雄蟲精子的輸送會受到光照節(jié)律的影響，當處于24L∶0D或0L∶24D的環(huán)境時，斜紋夜蛾雄蟲體內(nèi)精子的形成和輸送會受到抑制（Seth等，2002），嚴重影響交配和產(chǎn)卵。

4 結(jié)論

綜上所述，在黑水虻生存環(huán)境穩(wěn)定前提下，在光照強度3000 lux范圍內(nèi)，隨著強度增大，黑水虻的生長繁殖活動及產(chǎn)卵量增加；在設置的5個光照節(jié)律中，成蟲在的活躍程度和相對產(chǎn)卵量均無顯著差異。后續(xù)將進一步探究光照節(jié)律與光照強度等因素的交互作用對于黑水虻的影響，并合理控制，促進黑水虻的繁殖活動。