龍蒿精油納米膠囊制備工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)表征研究

梁 英 張慧蕓 康懷彬

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

龍蒿(ArtemisiadracunculusL.)，屬菊科蒿屬多年生草本植物，是一種重要的藥用和芳香植物[1-2]。龍蒿精油是通過蒸餾方法從龍蒿的花、莖、葉中提取得來，成分復雜，主要由甲基丁香酚、草蒿腦、α-蒎烯、β-蒎烯、羅勒烯、芳樟醇、檸檬烯等組成[3-5]。龍蒿精油具有助消化、利尿、開胃、催吐、驅(qū)蟲、止瀉、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、控制血糖、止痛、抗炎和抗癌等功效[6-8]，在醫(yī)藥、護膚和食品等領(lǐng)域中備受關(guān)注。但由于具有特殊性氣味、揮發(fā)性較強、難溶于水且易受溫度影響應用受限。

納米膠囊化技術(shù)能保持活性分子的生物活性及穩(wěn)定性，通過擴散過程來控制活性分子向納米膠囊周圍的釋放[9-10]。目前，離子凝膠法、噴霧干燥法、層層自組裝法和復合凝聚法等廣泛應用于納米膠囊的制備。其中，離子凝膠法具有成本低、操作簡便、無有機溶劑的優(yōu)點且制備的納米膠囊具有良好的穩(wěn)定性，因此被廣泛應用于食品、藥品、護膚品等領(lǐng)域[11]。在納米膠囊制備中，為保證所制備產(chǎn)品具有安全性高、無毒、無污染等特性，傾向于選擇天然高分子材料為壁材。殼聚糖(Chitosan，CS)是從甲殼類動物殼中經(jīng)過脫礦質(zhì)、脫蛋白和脫乙?；纬傻腫12]，具有生物相容性、抗菌性和抗氧化活性，并且是活性化合物持續(xù)釋放和傳遞的良好載體，是一種低成本材料，抑菌、無毒、安全性高的天然高分子聚合物[13]。Hasani等[14]以殼聚糖和改性淀粉為壁材，采用冷凍干燥法制備檸檬精油納米膠囊，粒徑范圍為553.3～3 393.0 nm，通過差示掃描量熱分析得出該納米膠囊具有良好的物理化學性能和熱穩(wěn)定性。Sotelo-Boyas等[15]以殼聚糖為壁材，分別采用納米沉淀法和納米膠囊法制備檸檬精油納米粒和檸檬精油納米膠囊，在透射電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)納米膠囊的平均粒徑高于納米粒。近年來，關(guān)于以植物精油為芯材制備微膠囊的研究越來越多，如丁香精油、肉桂精油和檸檬精油等，然而對龍蒿精油納米膠囊的研究卻未見報道。

研究擬以龍蒿精油為芯材，以CS為壁材，采用離子凝膠法制備龍蒿精油納米膠囊，研究制備條件對納米膠囊包埋率的影響，采用響應面法優(yōu)化納米膠囊制備工藝，同時對所制備納米膠囊進行表征分析，為龍蒿精油納米膠囊的制備及應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍蒿精油：食品級，江西環(huán)球天然香料有限公司；

殼聚糖：脫乙?；?5.0%，北京酷爾化學科技有限公司；

吐溫-80：分析純，天津市亞泰聯(lián)合化工有限公司；

三聚磷酸鈉：分析純，山東唐正生物科技有限公司；

溴化鉀：光譜純，天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

傅里葉變換中遠紅外光譜儀：VERTEX70型，德國Bruker公司；

高分辨透射電鏡：JEM-2100型，日本電子公司；

差示掃描量熱儀：DSC3型，瑞士Mettler-Toledo公司；

紫外可見光分光光度計：UV-2600型，日本島津公司；

臺式高速冷凍離心機：H1850R型，湖南湘儀離心機儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：LGJ-10D型，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 龍蒿精油納米膠囊的制備 參照文獻[16]的方法，并進行優(yōu)化制備龍蒿精油納米膠囊。將0.1 g CS溶解于50 mL乙酸溶液(體積分數(shù)1%)中，在60 ℃條件下磁力攪拌60 min后，形成CS溶液，并采用0.45 μm濾膜對其進行真空抽濾。加入約0.12 g的吐溫-80作為精油乳化劑，并在60 ℃下磁力攪拌10 min，以形成均勻的溶液。將200 mg精油滴入CS/吐溫-80溶液中，并在500 r/min 下攪拌60 min。將0.04 g三聚磷酸鈉(Sodium Tripolyphosphate，TPP)溶解于10 mL蒸餾水中制備TPP溶液，隨后，于500 r/min磁力攪拌下，將TPP溶液緩慢地加入到油載CS/吐溫-80溶液中，攪拌60 min后得到均勻的龍蒿精油納米膠囊分散液，添加0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)其pH 3.5。最后將該分散液在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心30 min，去除上清液，將得到的龍蒿精油納米膠囊懸浮于蒸餾水中，在1 Pa條件下凍干24 h，于4 ℃保存。

1.3.2 單因素試驗

(1) CS溶液pH對龍蒿精油納米膠囊包埋率的影響：采用1.3.1的制備方法，TPP與CS質(zhì)量比為0.4∶1.0，龍蒿精油與CS質(zhì)量比為1.4∶1.0，將CS溶液pH調(diào)節(jié)為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5。

(2) TPP與CS質(zhì)量比對龍蒿精油納米膠囊包埋率的影響：采用1.3.1的制備方法，CS溶液的pH為3.5，龍蒿精油與CS質(zhì)量比為1.4∶1.0，將TPP與CS質(zhì)量比分別設置為0.1∶1.0，0.2∶1.0，0.3∶1.0，0.4∶1.0，0.5∶1.0。

(3) 龍蒿精油與CS質(zhì)量比對龍蒿精油納米膠囊包埋率的影響：采用1.3.1的制備方法，CS溶液的pH為3.5，TPP與CS質(zhì)量比為0.4∶1.0，將龍蒿精油與CS質(zhì)量比分別設置為1.4∶1.0，1.6∶1.0，1.8∶1.0，2.0∶1.0，2.2∶1.0。

1.3.3 響應面試驗 根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，選取pH值、芯壁比以及TPP與CS的質(zhì)量比為目標變量，以龍蒿精油納米膠囊包埋率為因變量。

1.3.4 龍蒿精油納米膠囊包埋率的測定 參照文獻[17]的方法，并進行優(yōu)化。在4 ℃，10 000 r/min條件下，將龍蒿精油納米膠囊分散液離心30 min，收集上清液并用分光光度法于201 nm處測定其吸光度，并制備不含龍蒿精油的納米膠囊分散液作空白對照。計算未包埋的龍蒿精油量m2，再按式(1)計算包埋率。

(1)

式中：

EE——包埋率，%；

m1——龍蒿精油添加總量，g；

m2——納米膠囊懸浮液中未包埋的龍蒿精油量，g。

1.3.5 納米膠囊的高分辨透射電鏡形態(tài)觀察 取少量空白膠囊凍干粉和納米膠囊凍干粉作為樣品，加入乙醇超聲30 min制成懸浮液，滴入磷鎢酸(2%)染色3 min后，將銅網(wǎng)沒入染色液中，靜置30 min，濾紙吸去多余液體直至干燥，最后用高分辨透射電鏡在120 kV條件下觀察納米膠囊形態(tài)[18]。

1.3.6 龍蒿精油納米膠囊的傅里葉紅外光譜分析 參照文獻[19]的方法，稍加改進，使用純溴化鉀作為空白背景，將純CS粉、龍蒿精油、空白膠囊凍干粉和龍蒿精油納米膠囊凍干粉分別研磨后壓制成透明薄片，放入變換中遠紅外光譜儀中，在分辨率4 cm-1，4 000～400 cm-1的光譜范圍內(nèi)進行掃描。

1.3.7 龍蒿精油納米膠囊的差示掃描量熱儀分析 以純CS粉、龍蒿精油、空白膠囊凍干粉和龍蒿精油納米膠囊凍干粉為樣品，將樣品質(zhì)量控制在5～15 mg，升溫速率為15 ℃/min，測定溫度區(qū)間為30～450 ℃[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)取3次平行試驗的平均值，用Microsoft Excel 2010以及Design Expert 11對試驗數(shù)據(jù)進行處理(顯著性水平P<0.05)，用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.2 三聚磷酸鈉與殼聚糖質(zhì)量比對龍蒿精油納米膠囊包埋率的影響 由圖2可知，納米膠囊包埋率隨TPP與CS質(zhì)量比的增大呈先上升后平緩下降趨勢。這是由于聚陽離子CS可以與聚陰離子TPP發(fā)生靜電相互作用，從而產(chǎn)生納米膠囊[21]。隨著TPP與CS質(zhì)量比的增大，磷酸基團數(shù)量偏多，促使納米膠囊體系的形成，從而使納米膠囊包埋率升高。隨著TPP與CS質(zhì)量比的不斷增大，包埋率反而下降，可能是由于CS的量相對不足形成的納米膠囊壁較薄，不能完全包裹龍蒿精油，或者過量的TPP聚集在一起形成團簇，從而導致包埋率有所下降[19-20,22]。

圖1 殼聚糖溶液pH對龍蒿精油納米膠囊包埋率的影響

圖2 三聚磷酸鈉與殼聚糖質(zhì)量比對龍蒿精油納米膠囊包埋率的影響

2.1.3 龍蒿精油與殼聚糖質(zhì)量比對龍蒿精油納米膠囊包埋率的影響 由圖3可知，龍蒿精油納米膠囊的包埋率隨龍蒿精油與CS質(zhì)量比的增加呈先上升后下降趨勢。這是由于芯壁比增加，芯壁材間的接觸面積增加，有利于包裹龍蒿精油。當芯壁比過高(>2∶1)時，包埋率反而下降。這可能是由于相對于一定量的CS，龍蒿精油的量偏多，吐溫-80的量相對不足，導致吐溫-80的乳化效果較差、納米膠囊包裹不完全或者形成的納米膠囊的囊壁過薄，容易破裂并釋放出龍蒿精油，導致包埋率下降[20]。

圖3 龍蒿精油與殼聚糖質(zhì)量比對龍蒿精油納米膠囊包埋率的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面法設計與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設計響應面試驗因素水平表見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1 響應面試驗設計因素及水平

2.2.2 回歸方程的建立與顯著性分析 采用Design Expert 11軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行分析處理，得到回歸方差分析表，并進行多元線性擬合，得到龍蒿精油納米膠囊包埋率與各因素編碼值之間的多元二次回歸模型：

Y=43.94-0.694 9A+0.11B+1.95C-1.77AB+2.33AC+0.394BC-1.48A2-5.67B2-3.05C2。

(2)

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析?

2.2.3 各因素交互作用的響應曲面和等高線圖分析 由圖4可知，等高線呈橢圓形，隨著pH和芯壁比的增加，包埋率呈先增加后減少趨勢且響應曲面傾斜度高，說明pH和芯壁比的交互作用顯著，與表3中AB交互項的分析結(jié)果一致。由圖5可知，等高線呈橢圓形，隨著pH和TPP與CS的質(zhì)量比的增加，包埋率呈先增加后減少趨勢且響應曲面傾斜度較高，說明pH和TPP與CS的質(zhì)量比的交互作用顯著，與表3中AC交互項的分析結(jié)果一致。由圖6 可知，等高線呈圓形，隨著芯壁比和TPP與CS的質(zhì)量比的增加，包埋率呈先增加后減少趨勢且響應曲面傾斜度較高，說明芯壁比和TPP與CS的質(zhì)量比的交互作用不顯著，與表3中BC交互項的分析結(jié)果一致。因此，響應曲面法可以用來優(yōu)化龍蒿精油納米膠囊的制備工藝。

圖4 交互項AB的等高線和響應曲面Figure 4 Contour lines and response surfaces of the interaction term AB

圖5 交互項AC的等高線和響應曲面Figure 5 Contour lines and response surfaces of the interaction term AC

圖6 交互項BC的等高線和響應曲面Figure 6 Contour lines and response surfaces of the interaction term BC

2.2.4 響應面試驗模型的驗證 通過Design Expert 11軟件得出龍蒿精油納米膠囊的最佳制備工藝為芯壁比2∶1、pH 3.5，TPP與CS的質(zhì)量比0.4∶1.0，預測包埋率為44.25%。以預測條件進行驗證實驗，重復3次，得出龍蒿精油納米膠囊的平均包埋率為43.67%，結(jié)果穩(wěn)定可靠，由此可見通過響應面法優(yōu)化龍蒿精油納米膠囊制備工藝可行。

2.3 納米膠囊的高分辨透射電鏡形態(tài)觀察

高分辨透射電鏡在120 kV下放大105倍的龍蒿精油納米膠囊如圖7所示，納米膠囊均呈較規(guī)則圓形，是比較理想的顆粒形態(tài)。龍蒿精油納米膠囊的直徑約為40 nm，空白納米膠囊的直徑約為29 nm。

圖7 納米膠囊透射電鏡圖Figure 7 Transmission electron microscopy of the nanocapsules

2.4 龍蒿精油納米膠囊的傅里葉紅外光譜分析

a. 精油膠囊 b. 空白膠囊 c. 龍蒿精油 d. 殼聚糖粉圖8 傅里葉紅外光譜檢測結(jié)果Figure 8 Detection results of Fourier infrared spectrum

2.5 龍蒿精油納米膠囊的差示掃描量熱儀分析

由圖9可知，龍蒿精油的揮發(fā)速度隨溫度的升高而加快，在181 ℃時出現(xiàn)的吸熱峰是由龍蒿精油分解汽化引起的[20]。CS曲線中，在88 ℃出現(xiàn)的吸熱峰是由于CS中的水蒸發(fā)，在317 ℃出現(xiàn)的放熱峰是由于CS的分解?？瞻啄z囊在246 ℃出現(xiàn)放熱峰，可能是因為CS與TPP發(fā)生靜電相互作用，從而出現(xiàn)了能量變化[26]。與空白膠囊相比，精油膠囊在367 ℃出現(xiàn)的吸熱峰，可能是由于中間產(chǎn)物發(fā)生熱解焦化現(xiàn)象，導致龍蒿精油納米膠囊破裂釋放出龍蒿精油，進而引起龍蒿精油的分解汽化；與龍蒿精油相比，精油膠囊的吸熱峰由181 ℃提高到367 ℃，說明納米膠囊包埋了龍蒿精油，且對龍蒿精油起到了一定的保護作用，提高了龍蒿精油的熱穩(wěn)定性。精油膠囊曲線中，沒有龍蒿精油的特征峰，表明龍蒿精油與殼聚糖之間發(fā)生了相互作用，殼聚糖包埋龍蒿精油。Feyzioglu等[27]研究香薄荷精油納米粒子的制備，通過差示掃描量熱分析發(fā)現(xiàn)，香薄荷精油納米粒子的圖中沒有香薄荷精油的特征性熔融峰和結(jié)晶峰，表明殼聚糖包埋了香薄荷精油，與研究結(jié)果相似。

圖9 差示掃描量熱儀分析圖Figure 9 Analysis diagram of differential scanning calorimeter

3 結(jié)論

試驗通過離子凝膠法制備龍蒿精油納米膠囊，通過Box-Behnken試驗設計和響應面分析優(yōu)化納米膠囊制備工藝，得到龍蒿精油納米膠囊的最佳制備工藝條件為芯壁比2∶1、pH 3.5、TPP與CS的質(zhì)量比0.4∶1.0，此條件下制備的龍蒿精油納米膠囊的包埋率為43.67%。龍蒿精油納米膠囊呈較規(guī)則圓形，粒徑約為40 nm，具有良好的熱穩(wěn)定性。龍蒿精油納米膠囊對食品貯藏期間的防腐抗菌作用仍需進一步深入研究。