巖原鯉仔稚魚生長(zhǎng)發(fā)育過程中消化酶活性的變化

王垂瑾，王 堯，孫悅佳，高煜杰

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228)

巖原鯉(Procyprisrabaudi)屬鯉形目Cypriniformes、鯉科Cyprinidae、原鯉屬，俗稱巖鯉巴、巖鯉，其主要分布于長(zhǎng)江中上游的干流或支流水系，尤其以嘉陵江和岷江盛產(chǎn)，是長(zhǎng)江中上游重要的名貴經(jīng)濟(jì)魚類和特有魚類[1-2].巖原鯉肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，無肌間刺，具有較高的食用價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊.然而，巖原鯉生長(zhǎng)緩慢，性成熟周期長(zhǎng)，且由于受到過度捕撈、水域環(huán)境污染以及自然棲息地喪失等因素的影響而導(dǎo)致其種質(zhì)資源急劇下降，現(xiàn)已被《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書》列為易危物種[3-4].因此，建立高效的苗種培育技術(shù)體系對(duì)于恢復(fù)巖原鯉種群數(shù)量以及發(fā)展此優(yōu)質(zhì)品種的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)具有重要意義.

巖原鯉仔稚魚主要以浮游動(dòng)植物為食，然而浮游生物通常不足以幫助其順利度過生長(zhǎng)周期的初始階段.對(duì)于營(yíng)養(yǎng)需求而言，仔魚仍然要依賴卵黃囊的儲(chǔ)備，待卵黃耗盡后，仔魚必須開始攝取外部食物以滿足其生長(zhǎng)所需能量，魚體攝食餌料的效率取決于其消化能力以及攝入養(yǎng)分的吸收轉(zhuǎn)化效率[5-6].魚體消化酶的活性分析是一種簡(jiǎn)單而可靠的生化方法，通過其活性可以初步判斷魚體對(duì)餌料的消化能力，并且在一定程度上還可反映出魚體對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的需求狀態(tài)[7-8].因此，測(cè)定分析仔稚魚早期生長(zhǎng)發(fā)育階段的消化酶變化情況，有助于確定適宜的投喂策略和餌料配方，從而提高仔稚魚的成活率[9].

由于目前尚未有關(guān)于巖原鯉仔稚魚生長(zhǎng)發(fā)育和消化酶活性變化的研究報(bào)道，因此，本文主要研究了巖原鯉仔稚魚發(fā)育過程中的生長(zhǎng)情況以及消化酶活性的變化趨勢(shì)，旨在為解決仔稚魚培育階段成活率不高的瓶頸問題以及提高巖原鯉苗種人工培育的效率奠定理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料巖原鯉親本暫養(yǎng)于四川金沙江溪洛渡向家壩水電站的珍稀特有魚類增殖放流站，排卵前投喂人工配合飼料并適量補(bǔ)充水蚯蚓等生物餌料進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，繁殖期間水溫為18.5～20.0 ℃.巖原鯉的繁殖采用的是人工授精方式，擠壓經(jīng)催產(chǎn)的雌魚腹部，使其排卵于預(yù)先準(zhǔn)備好的容器內(nèi)，隨后立即將所采集的雄魚精液加入盛有魚卵的容器內(nèi)進(jìn)行授精.受精卵經(jīng)人工脫粘后用錐形桶孵化器進(jìn)行孵化，孵化密度約為600～800粒/L，采用曝氣微流水培育，日換水量約為10%～20%.巖原鯉仔魚開口階段采用輪蟲進(jìn)行投喂，密度約為5～6個(gè)/mL，于稚魚階段采用枝角類或橈足類的幼體投喂，密度約為2～3個(gè)/mL，每日投喂3次，其中，饑餓組不投喂餌料；養(yǎng)殖期間水溫約為(24±0.5)℃，溶解氧在5 mg/L以上，pH 7左右.

1.2 樣本采集分別在巖原鯉仔稚魚培育的1，2，3，4，5，6，7，9，11，13，17，21，25，30，35，40 d進(jìn)行取樣，取樣前24 h停止投喂.每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶隨機(jī)選取30尾仔稚魚，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量魚體全長(zhǎng)，以電子天平測(cè)量體重，用解剖顯微鏡觀察魚體的發(fā)育情況和形態(tài)特征，并依據(jù)公式SGR=100×(lnFBW-lnIBW)/T計(jì)算特定生長(zhǎng)率，其中 FBW為個(gè)體終末體重(g)，IBW為個(gè)體初始體重(g)，T為培育時(shí)間(d).在每個(gè)養(yǎng)殖桶中另取30尾于MS-222(質(zhì)量濃度為10 mg/L)溶液中麻醉.養(yǎng)殖前期取全魚樣本，后期個(gè)體較大時(shí)去除頭部、尾部和背部多余肌肉，保留軀干部，樣本置于1.5 mL無菌離心管中，立即放入液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)至-80 ℃的冰箱中以用于消化酶活性的測(cè)定.

1.3 消化酶活性的分析用生理鹽水潤(rùn)洗巖原鯉仔稚魚，準(zhǔn)確稱量后加入9倍體積的PBS溶液的冰浴勻漿，于4 ℃以3 500 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至離心管后保存于-80 ℃，待測(cè).勻漿液的蛋白含量是采用南京建成試劑盒并依據(jù)BCA法進(jìn)行測(cè)定；胰蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶和堿性磷酸酶的測(cè)定是分別參照上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司的魚胰蛋白酶活性試劑盒(ml064285)、魚脂肪酶活性ELISA試劑盒(ml652113)、魚α-淀粉酶ELISA試劑盒(ml036449)和魚堿性磷酸酶ELISA試劑盒(ml036436)的操作說明書進(jìn)行，在多功能酶標(biāo)儀上讀取相應(yīng)的OD值并計(jì)算相應(yīng)的結(jié)果.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)來表示，并使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當(dāng)差異顯著時(shí)(P<0.05)進(jìn)一步用Duncan來進(jìn)行多重比較和分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 巖原鯉仔稚魚的生長(zhǎng)情況經(jīng)過40 d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后，巖原鯉仔稚魚的生長(zhǎng)情況如圖1所示.結(jié)果顯示，巖原鯉仔稚魚的體重由2.44 mg增長(zhǎng)至67.1 mg，特定生長(zhǎng)率為8.29 %；全長(zhǎng)由8.11 mm增長(zhǎng)至23.05 mm.在仔稚魚的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，體長(zhǎng)和體重均呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)模式，擬合方程分別為y= 8.076e0.0261x(R2=0.981)，y=2.749e0.0806x(R2=0.973).在生長(zhǎng)初期(1～11 d)體長(zhǎng)和體重變化較為平緩，生長(zhǎng)后期(12 d)魚體增長(zhǎng)速度顯著增加.饑餓組巖原鯉仔稚魚的體長(zhǎng)和體重逐漸下降，在養(yǎng)殖第12天時(shí)全部死亡.

圖1 巖原鯉仔稚魚的體長(zhǎng)和體重變化

2.2 巖原鯉仔稚魚消化酶活性的變化情況巖原鯉仔稚魚消化酶活性的變化如下圖2所示，結(jié)果顯示，在巖原鯉仔稚魚孵化的初始階段均能夠檢測(cè)出胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和堿性磷酸酶的活性，其中，胰蛋白酶活性在孵化后的1～9 d呈現(xiàn)出顯著上升趨勢(shì)(P<0.05)，而后在10～17 d開始顯著下降，20 d后開始顯著上升，直至35 d時(shí)達(dá)到峰值(P<0.05)，隨后40 d時(shí)又顯著下降至57.33 U/mg.巖原鯉仔稚魚的脂肪酶活性在開口前4 d無顯著變化(P>0.05)，從5 d至21 d有緩慢升高的趨勢(shì)，而后在25～30 d時(shí)極顯著增加并達(dá)到峰值(P<0.05)，隨后又開始顯著下降，在40 d時(shí)下降至較低水平.巖原鯉仔稚魚淀粉酶活性在開口前3 d有下降趨勢(shì)，隨后上升(5 d)至初始孵化水平，至17 d時(shí)總體變化并不顯著(P>0.05)，25 d后開始顯著上升(P<0.05)，直至30 d時(shí)達(dá)到峰值，并維持到35 d，而后開始顯著下降，到40 d時(shí)淀粉酶活性依舊高于前期(1～25 d)生長(zhǎng)發(fā)育階段的淀粉酶活性.巖原鯉仔稚魚的堿性磷酸酶活性在生長(zhǎng)發(fā)育前期(1～25 d)的變化不顯著(P>0.05)，25 d后開始顯著上升(P<0.05)，在35 d時(shí)達(dá)到峰值，而后在40 d時(shí)下降到初始水平.

圖2 巖原鯉仔稚魚在不同生長(zhǎng)階段的消化酶活性變化

2.3 饑餓對(duì)巖原鯉仔稚魚消化酶活性變化的影響如圖3所示，與投喂組相比，巖原鯉仔稚魚胰蛋白酶和脂肪酶的活性受饑餓狀態(tài)的影響最為顯著(P<0.05)，而淀粉酶和堿性磷酸酶活性雖在饑餓狀態(tài)下低于投喂組的淀粉酶和堿性磷酸酶活性，但差異并不顯著(P>0.05).在饑餓情況下，巖原鯉仔稚魚胰蛋白酶活性在5～11 d期間呈顯著下降的趨勢(shì)，且在9 d和11 d時(shí)顯著低于投喂組的胰蛋白酶活性(P<0.05)；在饑餓情況下,脂肪酶活性在5～11 d期間呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在11 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)的脂肪酶活性.

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巖原鯉仔稚魚于生長(zhǎng)階段呈現(xiàn)出指數(shù)生長(zhǎng)模式，與石首魚(TotoabamacdonaldiGilbert, 1890)[10]、細(xì)點(diǎn)牙鯛(Dentexdentex)[11]、亞馬遜河琵琶鯰(Pseudoplatystomapunctifer)[12]、波斯鱘(Acipenserpersicus)[7]等魚類仔稚魚的生長(zhǎng)模式一致.但在鱸鯉中的研究顯示，其仔稚魚體長(zhǎng)和體重的變化分別是線性和三項(xiàng)式模式[13]，而大鱗副泥鰍仔稚魚的體長(zhǎng)和體重的變化分別是線性和指數(shù)模式[14].由此可見，不同種魚類其仔稚魚生長(zhǎng)發(fā)育的模式存在一定差異.有如文獻(xiàn)報(bào)道[15]，巖原鯉于仔稚魚階段其生長(zhǎng)也較其他多數(shù)魚類相對(duì)緩慢(SGR 8.29).同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巖原鯉于仔稚魚發(fā)育初期(0～11 d時(shí))其生長(zhǎng)相對(duì)緩慢(SGR 4.7)，而后其生長(zhǎng)開始顯著加速(13～40 d，SGR 9.33).巖原鯉于仔稚魚初期其生長(zhǎng)緩慢的主要原因可能是：魚體處于組織器官發(fā)育的關(guān)鍵階段，從卵黃攝取的大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育，而不是用于軀干部分的生長(zhǎng)；另外，此階段消化器官的較低發(fā)育水平也在一定程度上限制了其對(duì)餌料的消化吸收和利用；再就是所投喂的生物餌料不足以完全滿足此階段魚體的生長(zhǎng)發(fā)育，這也可能是重要因素之一[16].

圖3 投喂和饑餓對(duì)巖原鯉仔稚魚消化酶活性的影響

研究仔稚魚早期生長(zhǎng)階段的發(fā)育狀態(tài)和消化酶活性的變化情況能夠使我們了解其對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的利用能力，并依此建立有效的仔稚魚投喂策略，提高其成活率.本研究顯示，在巖原鯉仔稚魚開口前的初始孵化階段均能夠檢測(cè)到胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和堿性磷酸酶的活性，表明這些消化酶在沒有外源食物刺激時(shí)其主要是由內(nèi)源自身合成并受相應(yīng)基因調(diào)控，而且它們參與了卵黃營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與分解.同樣，在大鱗副泥鰍[15]、黃尾鰤 (Seriolalalandi)[17]、亞馬遜河琵琶鯰[12]等大多數(shù)魚類的仔稚魚初孵階段均檢測(cè)出消化酶活性.

在魚類仔稚魚發(fā)育階段，蛋白質(zhì)是重要的營(yíng)養(yǎng)和能量物質(zhì)，其中內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)階段主要依靠卵黃供給，而在開口之后其營(yíng)養(yǎng)主要由外源食物提供.外源食物中蛋白質(zhì)或氨基酸含量能夠有效促進(jìn)魚體蛋白酶的分泌[18].Cara等的研究顯示，胰蛋白酶活性是反映仔稚魚營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的良好指標(biāo)[19].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，巖原鯉仔稚魚胰蛋白酶的活性遠(yuǎn)高于脂肪酶等其他消化酶的活性，這進(jìn)一步說明蛋白質(zhì)/氨基酸是此階段其生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且在后期(15 d)當(dāng)其生長(zhǎng)速度加快時(shí)胰蛋白酶的活性也隨之顯著升高，并在35 d時(shí)達(dá)到峰值.而巖鯛(Oplegnathusfasciatus)[20]和歐洲鰉(Husohuso)[21]的胰蛋白酶活性在快速生長(zhǎng)初期(10～20 d)即達(dá)到峰值，隨后顯著下降(30～50 d).細(xì)點(diǎn)牙鯛[11]、塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)[22]和北美牙鲆(Paralichthyscalifornicus)[23]的研究顯示，胰蛋白酶活性在初始孵化階段最高，而后隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行其活性顯著下降.然而Mourente等認(rèn)為，細(xì)點(diǎn)牙鯛在胚胎發(fā)育階段，蛋白質(zhì)和氨基酸是其主要的能量物質(zhì)來源，而在卵黃營(yíng)養(yǎng)階段脂質(zhì)比蛋白質(zhì)或碳水化合物更為重要[11].由此可見，不同魚類在仔稚魚生長(zhǎng)階段其對(duì)能量物質(zhì)的需求差異也可能是導(dǎo)致相應(yīng)消化酶活性發(fā)生不同變化的重要因素.細(xì)點(diǎn)牙鯛的脂肪酶活性在發(fā)育早期階段(0～19 d)顯著升高，而后開始顯著下降.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巖原鯉仔稚魚的脂肪酶活性在生長(zhǎng)發(fā)育前期顯著升高(0～11 d)，而后在30 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后顯著下降到較低水平，在鯉科魚類鱸鯉的研究中也顯示出類似的變化趨勢(shì)[13].

本研究顯示，巖原鯉仔稚魚的淀粉酶活性顯著低于其他消化酶類.在西伯利亞鱘(Acipenserbaeribrandt)[24]、美國(guó)紅魚(Sciaenopsocellatus)[25]和大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[26]等魚類的研究中同樣發(fā)現(xiàn)仔稚魚內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期的淀粉酶活性也很低，但是在攝入外源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后淀粉酶活性顯著升高.而浮游動(dòng)物等生物餌料中含有的碳水化合物也是誘導(dǎo)仔稚魚淀粉酶合成和分泌增多的主要原因.但在亞馬遜河琵琶鯰仔魚階段發(fā)現(xiàn)其具有較高的淀粉酶活性，其卵黃中大量沉積的糖原是誘導(dǎo)淀粉酶大量分泌的主要原因[12].因此，不同魚類所表現(xiàn)出的淀粉酶活性差異與其攝食習(xí)性和消化生理狀態(tài)有關(guān).在巖原鯉仔稚魚生長(zhǎng)發(fā)育后期淀粉酶活性逐漸升高也表明其逐漸表現(xiàn)出雜食性的特點(diǎn)，能夠相對(duì)較好地消化和利用餌料中的碳水化合物.堿性磷酸酶活性能夠在一定程度上反映仔稚魚腸道的發(fā)育狀況[27].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示巖原鯉仔稚魚的堿性磷酸酶活性在發(fā)育初期(0～25 d)并無顯著性變化，而后其活性顯著升高并在35 d時(shí)達(dá)到峰值，表明此仔稚魚在快速生長(zhǎng)期其消化器官的發(fā)育也逐步發(fā)育成熟.在巖鯛的研究中發(fā)現(xiàn)其堿性磷酸酶活性在19 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后并無顯著下降趨勢(shì)，且其仔稚魚堿性磷酸酶活性的變化規(guī)律與攝入餌料的脂肪組成密切相關(guān)[20].

前期研究發(fā)現(xiàn)，仔稚魚消化器官發(fā)育和消化酶分泌受到餌料種類、營(yíng)養(yǎng)組成以及餌料豐度的影響[28-29].本研究顯示，巖原鯉仔稚魚于饑餓狀態(tài)下其胰蛋白酶和脂肪酶活性顯著降低，而淀粉酶和堿性磷酸酶的活性略低于攝食組，表明其對(duì)饑餓狀態(tài)不敏感.在鮸魚(Miichthysmiiuy)的研究中則顯示其脂肪酶和淀粉酶的活性未受饑餓狀態(tài)顯著影響，但饑餓后胰蛋白酶和堿性磷酸酶的活性顯著低于攝食組[30].開口后于饑餓狀態(tài)下，巖原鯉仔稚魚12 d時(shí)的成活率為零，同樣，在日本牙鲆(Paralichthysolivaceus)[31]的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.綜上所述，巖原鯉仔稚魚在孵化后即能夠檢測(cè)到消化酶的活性，并在30 d左右達(dá)到峰值，此時(shí)也是其生長(zhǎng)速度較快時(shí).巖原鯉于仔稚魚階段其胰蛋白酶和脂肪酶的活性較高，表明在仔稚魚發(fā)育階段蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪是其主要的能量來源，而在饑餓狀態(tài)下巖原鯉開口7 d后死亡，胰蛋白酶和脂肪酶的活性也顯著降低；因此，在巖原鯉仔稚魚發(fā)育階段有必要為其提供含豐富蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)的餌料，以促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育.