淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)和NaCl成分對氣態(tài)ClO2殺菌效果的影響

畢秋蕓

(淄博職業(yè)學(xué)院制藥與生物工程系，山東 淄博 255314)

二氧化氯(ClO2)是一種具有獨特氣味的黃綠色氣體[1]。它極易溶于水并以非水解形式形成水溶液[2]。ClO2是一種應(yīng)用范圍較廣的殺菌劑，作為一種高選擇性氧化劑，由于其獨特的單電子機(jī)制，能攻擊有機(jī)分子中富含電子的中心，并被還原為亞氯酸根離子[3]，其殺菌原理主要是對微生物細(xì)胞表面膜蛋白(包括參與運輸?shù)拿?進(jìn)行氧化攻擊[4]。ClO2能氧化酶中的巰基(—SH)和二硫化物(—S—S—)，使其生理功能失效。Young等[5]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜的損傷會使枯草芽孢桿菌的孢子失活，雖然受ClO2氧化損傷的孢子可以萌發(fā)，但不能繼續(xù)生長發(fā)育。ClO2主要以分子形式存在，很容易穿透細(xì)菌細(xì)胞膜，從而改變跨膜離子梯度并抑制呼吸，同時ClO2也會破壞微生物中的蛋白質(zhì)合成[6]。

氣態(tài)ClO2和ClO2溶液作為消毒劑在食品殺菌領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛[7]。作為一種消毒劑，氣態(tài)ClO2比ClO2溶液具備更多的優(yōu)勢，具體表現(xiàn)在其高氧化能力，與有機(jī)物的反應(yīng)性低，在低濃度和pH 3.0～8.0的范圍內(nèi)殺菌效率很高，并且不會與氨、腐殖酸或其他有機(jī)前體反應(yīng)形成有害的氯胺、氯酚和三鹵甲烷[8]。ClO2氣體還具有很強(qiáng)的滲透性和強(qiáng)溶解性，使其能夠盡可能地降低食品或與食品接觸面的微生物含量[9]。濃度、接觸時間、相對濕度以及溫度是影響氣態(tài)ClO2殺菌效果的主要因素[10]。ClO2的主要缺點是由它的不穩(wěn)定性而形成的無機(jī)副產(chǎn)物，如亞氯酸鹽和氯酸鹽[11]。

研究擬先確定各種食源性病原體和腐敗微生物對氣態(tài)ClO2的敏感性。由于腌制肉類及黃瓜、胡蘿卜等加工過的蔬菜變質(zhì)與腸膜明串珠菌有關(guān)，因此以腸膜明串珠菌為測試對象，探究食品中脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及氯化鈉等成分，對氣態(tài)ClO2殺菌效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食源性微生物革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、霉菌孢子、細(xì)菌芽孢、酵母菌：中國藥品生物制品檢驗所；

NaOH、HCl、KI、硫代硫酸鈉：分析純，成都西亞化工股份有限公司；

紫外/可見光光度計：Alpha-1900SPlus型，上海譜元儀器有限公司；

離心機(jī)：5930型，久保田商事株式會社；

顯微鏡：SteREO Discovery.V20型，德國卡爾蔡司公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株、孢子懸浮液的培養(yǎng)和制備 將細(xì)菌和酵母接種到5 mL無菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，取一環(huán)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到5 mL的肉湯中培養(yǎng)24 h，然后將培養(yǎng)物保存在7 ℃的瓊脂斜面上。霉菌在7 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上保存。分生孢子懸浮液通過將一些產(chǎn)孢菌絲體無菌轉(zhuǎn)移到Eppendorf試管中而制成的，試管中分別填充有1 g/L細(xì)菌蛋白胨和8.5 g/L NaCl的無菌溶液，然后將0.1 mL分生孢子懸浮液分散在PDA平板上。通過Marquenie等[12]的方法從培養(yǎng)皿中獲得孢子。用5 mL無菌0.3 g/100 mL吐溫-20溶液洗滌每個平板，并用無菌玻璃棉過濾孢子懸浮液兩次，去除菌絲碎片，然后，濾液在3 700×g下離心15 min。將沉淀的孢子重新懸浮于4 mL pH 7.2的無菌磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L)中。

為了制備蠟狀芽孢桿菌孢子的懸浮液，按照Gaillard等[13]的方法制備產(chǎn)孢培養(yǎng)基。分別將1 mL濃度40 mg/L MnSO4滅菌溶液和濃度100 mg/L CaCl2滅菌溶液添加到1 L的營養(yǎng)瓊脂中，然后，倒入培養(yǎng)皿，接種100 μL 經(jīng)24 h培養(yǎng)的蠟樣芽胞桿菌。溫育4 d后，用無菌拭子刮平培養(yǎng)皿，用10 mL蛋白胨/NaCl溶液搖勻。將孢子懸浮液加熱至80 ℃保持10 min以破壞營養(yǎng)細(xì)胞。最后通過顯微鏡檢查孢子懸浮液的萌發(fā)孢子。

1.2.2 氣態(tài)ClO2處理 圖1為ClO2氣體處理系統(tǒng)示意圖，處理系統(tǒng)包括汽提塔、處理室和取樣裝置(圖1C)。汽提塔通過塑料管與處理室相連，處理室包含12個培養(yǎng)皿。通過溫濕度計測量室內(nèi)的溫度和相對濕度。在左側(cè)與采樣設(shè)備建立了連接。穿孔管保證了室內(nèi)ClO2氣體的分布。將用于處理的培養(yǎng)皿放置在入口管上方的穿孔塑料板上(圖1A和B)。柜蓋中央的風(fēng)扇保證了ClO2的快速均勻分布。

圖1 ClO2氣體處理系統(tǒng)示意圖Figure 1 Diagram of the ClO2 gas treatment system

12個培養(yǎng)皿可以同時處理。每次處理前，通過4 L/h的熱濕空氣流將處理室內(nèi)的相對濕度調(diào)節(jié)至90%以上，溫度控制為(25±3) ℃。通過水浴法將0.01%的ClO2溶液加熱至48 ℃，并通過壓縮空氣將ClO2從溶液中分離出來。每0.5 min對試驗箱中的空氣采用空氣取樣泵進(jìn)行取樣，以1 L/min的速率從試驗箱中取出樣品。在處理室和取樣泵之間連續(xù)放置兩個含有25 mL 7 g/100 mL KI緩沖溶液(pH 7.0)的洗滌瓶，使得含有ClO2的空氣被吸入碘化鉀溶液。定量轉(zhuǎn)移兩個洗滌瓶的樣品并添加3 mL HCl (6 mol/L)溶液，用0.002 mol/L 硫代硫酸鈉滴定混合物至無色終點，以1 g/100 mL可溶性淀粉為指示劑。

?黃亞平:《“新型城鎮(zhèn)化”概念內(nèi)涵、目標(biāo)內(nèi)容、規(guī)劃策略及認(rèn)知誤區(qū)解析》，《城市規(guī)劃學(xué)刊》2013年第2期。

處理結(jié)束后，打開蓋子，取出培養(yǎng)皿。在初步試驗后選擇ClO2氣體濃度和處理時間，以確定閾值并進(jìn)行量化分析。

1.2.3 微生物對氣態(tài)ClO2的敏感性 分別在瓊脂平板上接種100 μL的細(xì)菌、酵母菌、霉菌孢子懸浮液。在室溫下放置30 min后，于1 min(0.5 min供氣+0.5 min取樣時間)內(nèi)用ClO2處理6個接種板。3個未經(jīng)處理的瓊脂平板作為對照。

1.2.4 不同食物成分對ClO2殺菌效果的影響 腸膜明串珠菌的原代培養(yǎng)物在7 ℃的胰蛋白胨大豆瓊脂斜面上保存，將接種物轉(zhuǎn)移到5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，并于30 ℃ 下孵育24 h。

為了研究可溶性多糖的影響，在MRS瓊脂中加入濃度為0，1，10，30 g/100 mL的可溶性淀粉。同樣，用濃度為0，1，3，5 g/100 mL NaCl制備平板培養(yǎng)基。用玉米油和未加鹽的黃油研究油脂存在的影響。玉米油、熔融態(tài)黃油和MRS瓊脂在121 ℃下分別蒸壓15 min。冷卻到48 ℃后，將玉米油和黃油添加到瓊脂中，以獲得最終的油脂濃度為1，10，30 mL/100 mL。隨后，添加Tween-20以穩(wěn)定這些乳劑，使其最終濃度達(dá)到0.005 mL/100 mL。為了研究蛋白質(zhì)存在的影響，采用pH為5.0～5.2的等電點乳清蛋白、含85%β-乳球蛋白和15%α-乳清蛋白(濃度分別為0，1，7 g/100 mL)進(jìn)行研究。當(dāng)乳清蛋白分離物濃度較高時，MRS瓊脂不能正常固化，將乳清分離蛋白粉末以干粉形式分別蒸壓(15 min，121 ℃)。將經(jīng)過調(diào)質(zhì)的MRS瓊脂添加到蛋白質(zhì)粉末中，以獲得所需的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.5 微生物分析 將每個培養(yǎng)皿中的瓊脂轉(zhuǎn)移到無菌袋中，進(jìn)行稀釋并將稀釋液涂在瓊脂培養(yǎng)基上，用MRS瓊脂平板進(jìn)行食品成分試驗。在30 ℃下孵育2 d后記錄菌落總數(shù)。

1.2.6 ClO2處理對乳液過氧化物值的影響 以濃度為0.005 mL/100 mL 的吐溫-20為乳化劑，制備濃度為0%，1%，10%或30%玉米油乳液，并以0.005%吐溫-20溶液為對照。用Gray[14]的方法測定各乳液處理前后的過氧化值。將5 mL 各種樣品乳液溶解在10 mL氯仿/乙酸混合液中(體積比為2∶3)。然后，加入3 mL 14 g/100 mL 的KI溶液，將混合物置于黑暗中1 min。加入20 mL 1 g/100 mL的淀粉溶液作為指示劑后，用0.01 mol/L 硫代硫酸鈉溶液滴定混合物至無色終點，得到樣品中的過氧化值。

1.2.7 ClO2處理對乳清蛋白分離物中羰基含量以及—SH 和—S—S—基團(tuán)的影響 將1%和7 g/100 mL乳清蛋白分離液處理為乳狀液，并于5 000×g離心8 min。分別經(jīng)ClO2(1.38 mg/L)處理10 min以及ClO2(0.08 mg/L)處理1 min后，測定溶液中羰基含量。1%乳清蛋白分離液經(jīng)ClO2(1.38 mg/L)處理10 min后，檢測其—SH和—S—S—的含量。

1.2.8 統(tǒng)計分析 用SPlus 7.0軟件進(jìn)行所有的統(tǒng)計分析工作。由于數(shù)據(jù)的非正態(tài)性，使用非參數(shù)Krus-kal-Wallis檢驗分析經(jīng)ClO2處理后獲得的微生物減少量。使用Mann-Whitney檢驗比較兩組試驗之間的平均微生物減少量。這兩種分析方法目的均是為了研究食物成分對ClO2殺菌效果的影響，以及ClO2處理對過氧化物值和羰基的影響。為了確定處理前后—SH和—S—S—含量差異的顯著性，采用假設(shè)方差相等和不相等的t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 常見食物微生物對氣態(tài)ClO2的敏感性

表1顯示了在室溫和相對濕度(90.0±0.5)%環(huán)境下，用(0.08±0.02) mg/L ClO2對微生物處理1 min后，各類微生物的平均減少量情況。除熒光假單胞菌受ClO2的影響較小，其他革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的平均下降量分別為3.5，2.6 lg (CFU/cm2)。酵母菌的平均下降量為1.1 lg (CFU/cm2)，而蠟樣芽孢桿菌和霉菌孢子的平均下降量很小。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的平均下降量差異顯著。除熒光假單胞菌和革蘭氏陽性菌外，酵母菌對ClO2抗性顯著高于革蘭氏陰性菌類的其他細(xì)菌，但低于霉菌孢子和蠟樣芽胞桿菌。

一般來說，革蘭氏陰性菌對ClO2的抗性優(yōu)于革蘭氏陽性菌，而酵母菌表現(xiàn)出中等抗性，霉菌孢子和蠟樣芽孢桿菌是最具抗性的微生物。然而，熒光假單胞菌卻表現(xiàn)出非常優(yōu)異的抗性，表明用ClO2處理熒光假單胞菌引起的腐敗是很困難的。此外，雖然盡可能的控制ClO2處理微生物的過程，但大多數(shù)的微生物對數(shù)減少率的基本偏差在0.5以上。基本偏差可能是由于工藝參數(shù)的變化影響，如ClO2汽提程度、相對濕度、溫度和室內(nèi)氣體的分布。

表1 ClO2處理過的微生物平均減少量

目前關(guān)于氣態(tài)ClO2對食源性微生物殺菌作用的影響相關(guān)研究很少。據(jù)Han等[16]的研究報道，相比于乳酸菌，氣態(tài)ClO2更容易滅活酵母菌和霉菌的混合物。Reina等[17]研究了ClO2溶液對各種腐敗微生物的影響，根據(jù)其研究，ClO2溶液對酵母菌和霉菌的滅菌效果更為理想。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌對ClO2氣體抗性的不同，可能是由于革蘭氏陰性菌具有易于被ClO2穿透的板網(wǎng)肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，而革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁是三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2.2 食物成分對氣態(tài)ClO2殺菌效果的影響

圖2顯示了在室溫和相對濕度(90.0±0.5)%的環(huán)境氛圍下，不同濃度的可溶性淀粉、氯化鈉、乳清蛋白分離物、玉米油及黃油對氣態(tài)ClO2[濃度(0.08±0.02) mg]處理腸膜明串珠菌的影響。

由圖2(a)可知，可溶性淀粉的存在對ClO2的殺菌效果沒有顯著影響。然而，添加相同濃度淀粉的瓊脂培養(yǎng)基在試驗1和試驗2之間，微生物減少量變化約為1 lg (CFU/cm2)。由圖2(b)可知，試驗1中，含有不同濃度NaCl的瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)ClO2處理后的微生物減少量差異不大。而在試驗2中，未添加NaCl的瓊脂培養(yǎng)基和添加5% NaCl的瓊脂培養(yǎng)基菌落數(shù)相差約2 lg (CFU/cm2)。由圖2(c)可知，乳清蛋白對ClO2的殺菌效果影響顯著。1%濃度的乳清蛋白使ClO2的抑菌效果顯著降低，而用7%的乳清蛋白和1%的乳清蛋白對二氧化氯的抑菌效果影響差不多。由圖2(d)和(e)可知，相對較低的玉米油或黃油濃度(1%)顯著降低了ClO2的殺菌效果。將黃油濃度從1%提高到10%對ClO2的抑菌效果沒有顯著影響，而30%則顯著降低了ClO2的抑菌效果。

雖然，在MRS瓊脂中添加淀粉或NaCl對ClO2的殺菌效果影響不大。但低濃度的油脂或蛋白質(zhì)明顯降低了ClO2的殺菌作用。

目前還沒有關(guān)于食品成分對ClO2殺菌效果影響的研究報道，但食品成分對臭氧殺菌效果的影響已經(jīng)得到了證實。與試驗結(jié)果相似，富含蛋白質(zhì)的食物基質(zhì)如牛血清白蛋白、酪蛋白酸鹽、牛奶或肉湯降低了臭氧的殺菌作用[18]，鮮奶油也會降低臭氧的殺菌作用[19]。蛋白質(zhì)和脂質(zhì)也降低了脈沖強(qiáng)光的殺菌作用。碳水化合物則根據(jù)微生物的不同而對殺菌的影響也不同[20]。

2.3 ClO2對油脂過氧化值和和乳清蛋白中羰基含量及—SH、—S—S—基團(tuán)濃度的影響

在室溫及相對濕度為(90.0±0.5)%環(huán)境氛圍用ClO2處理1 min后，ClO2對玉米油乳劑過氧化值和乳清蛋白中羰基和—SH和—S—S—基團(tuán)的影響如表2所示。從表2可以看出，用0.08 mg/L ClO2處理玉米油乳液1 min 后，所有乳劑的過氧化值都顯著增加。在0.08 mg/L ClO2處理下，1%和7%乳清蛋白溶液的羰基含量沒有顯著增加，但1.38 mg/L ClO2處理后，羰基含量顯著增加，1%乳清蛋白溶液的羰基含量增加了6倍以上，而7%乳清蛋白溶液中羰基含量的上升不太明顯，但仍達(dá)到145%。使用1.38 mg/L ClO2處理10 min后，1%乳清蛋白溶液中的—SH基團(tuán)顯著降低，而總巰基量沒有顯著降低。研究結(jié)果表明，用1.38 mg/L ClO2處理后能夠誘導(dǎo)—SH到—S—S—的半轉(zhuǎn)化。

U. 接種但未經(jīng)ClO2處理的參考樣品 T. 經(jīng)氣態(tài)ClO2處理的接種樣品圖2 食物成分對氣態(tài)ClO2殺菌效果的影響Figure 2 Effects of food components on the antimicrobial activity of gaseous ClO2

表2 ClO2對玉米油乳劑過氧化值和和乳清蛋白中羰基含量及—SH、—S—S—基團(tuán)濃度的影響?

ClO2的殺菌性能受蛋白質(zhì)和脂肪的影響很大。原因是ClO2的強(qiáng)氧化特性及能與許多有機(jī)化合物進(jìn)行反應(yīng)。油脂存在時抗微生物效果降低可能是由于油脂中抗氧化劑(如油中的生育酚)和ClO2發(fā)生反應(yīng)所致[21]。3種不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和亞油酸)約占玉米油脂肪酸含量的85%，而黃油主要含有飽和脂肪酸。鑒于ClO2氧化脂肪酸的程度與油脂中的雙鍵數(shù)量密切相關(guān)，而1%的脂肪已經(jīng)提供了足夠的反應(yīng)性位點，以消除0.08 mg/L ClO2處理的殺菌作用[22]。因此1%的黃油和1%的玉米油對ClO2殺菌效果的影響程度十分相似。這一點已被油—水乳劑的過氧化值的顯著增加所證實。

乳清蛋白顯著降低了ClO2的殺菌作用。ClO2會與酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸以及含硫氨基酸半胱氨酸和三肽谷胱甘肽發(fā)生反應(yīng)，從而消耗了可用作消毒劑的ClO2的量[23]。乳清蛋白分離物含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)約5%的含硫氨基酸。經(jīng)過ClO2處理后，由ClO2誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化會促使芳香族氨基酸暴露，并可能導(dǎo)致還原的巰基(SH)基團(tuán)增加暴露[24]。這項研究證實了ClO2增加了羰基含量并將—SH基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)椤猄—S—基團(tuán)，然而，濃度為1.38 mg/L的ClO2可顯著提高羰基含量和降低—SH 含量，而較低濃度的ClO2則有明顯的滅活作用。

3 結(jié)論

淀粉、NaCl對氣態(tài)ClO2的殺菌效果影響不大，而油脂和蛋白質(zhì)則顯著降低了ClO2的殺菌作用。因此，在處理富含蛋白質(zhì)和/或脂類的食品(如肉和魚制品)時，與富含碳水化合物的食品(如面包房產(chǎn)品、蔬菜和水果)相比，氣態(tài)ClO2的殺菌效果較差。由于細(xì)菌芽孢、酵母菌、霉菌和假單胞菌是富含蛋白質(zhì)和/或脂類的食品腐敗的重要原因，因此需要較長的接觸時間和/或高濃度的ClO2來滅活這些更具抗性的微生物。