單雙脂肪酸甘油酯/磷脂復(fù)配對(duì)嬰兒配方奶粉乳液中脂溶性營(yíng)養(yǎng)素生物可給性的影響

胡俊杰 李 艷 崔歡歡

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

食物中的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素如脂溶性維生素、不飽和脂肪酸(DHA、ARA等)及類胡蘿卜素等是提高嬰幼兒免疫力、促進(jìn)其健康發(fā)育的必不可少的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素。研究[1]表明，維生素D對(duì)嬰幼兒時(shí)期的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育具有極為重要的促進(jìn)和保護(hù)作用，可有效防治佝僂病。類胡蘿卜素是人類重要的維生素A來源，對(duì)視力發(fā)育及改善有重要作用[2]。然而，脂溶性營(yíng)養(yǎng)素大多存在水相溶解性差、易氧化分解、化學(xué)穩(wěn)定性差的特點(diǎn)，其生物可利用度低[3]。同時(shí)，人體對(duì)一般食品中類胡蘿卜素的吸收率僅為5%～30%[4]，極大地限制了其在體內(nèi)相關(guān)功效的發(fā)揮。母乳中雖然部分脂溶性營(yíng)養(yǎng)素如維生素D和類胡蘿卜素等含量遠(yuǎn)低于配方奶粉中允許添加量，卻仍能滿足嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)需求，由此可推斷母乳中營(yíng)養(yǎng)素活性形式和營(yíng)養(yǎng)素的吸收方式可能是主要的影響因素。

研究[5]表明，母乳中天然存在磷脂、膽固醇、單雙脂肪酸甘油酯等極性脂質(zhì)，這些極性脂質(zhì)與蛋白一起構(gòu)成了母乳乳液特殊的表面結(jié)構(gòu)，在營(yíng)養(yǎng)素吸收中發(fā)揮著重要作用。Lu等[6]的體外消化試驗(yàn)表明，單脂肪酸甘油酯的添加能提升食品體系中的類胡蘿卜素的生物可給性。Marriage等[7-8]的動(dòng)物試驗(yàn)表明，單、雙脂肪酸甘油酯及磷脂的混合體系對(duì)葉黃素的吸收有提升作用?，F(xiàn)有嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)過程中普遍僅采用較為傳統(tǒng)的乳化體系如乳蛋白和磷脂等，且研究的重點(diǎn)多為仿制母乳脂肪制備乳液[9-10]，有關(guān)通過模擬母乳界面脂質(zhì)群結(jié)構(gòu)的方式對(duì)脂溶性營(yíng)養(yǎng)素的吸收效率進(jìn)行研究尚未見報(bào)道。因此，傳統(tǒng)乳化體系生產(chǎn)的嬰兒配方粉的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素吸收率普遍較低。Bettler等[11]研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒對(duì)嬰兒配方粉中類胡蘿卜素(葉黃素)的吸收效率僅為母乳中類胡蘿卜素(葉黃素)的1/4。

試驗(yàn)擬以嬰兒配方奶粉乳液為模式體系，通過復(fù)配添加母乳中存在的極性脂質(zhì)成分——單雙脂肪酸甘油酯(mono-，di-glyceride，MDG)及磷脂(phospholipid,PL)，研究其對(duì)乳液消化行為和脂溶性營(yíng)養(yǎng)素(維生素D、β-胡蘿卜素)生物可給性的影響，并探索不同組成結(jié)構(gòu)的單、雙脂肪酸甘油酯的影響效果差異，以期為未來的嬰兒配方奶粉升級(jí)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乳清濃縮蛋白(WPC)：約為85%，Hilmar 8010，美國(guó)希爾瑪配料公司；

混合植物油：葵花籽油/大豆油，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；

中鏈脂肪酸甘油酯(MCT)：博星化學(xué)試劑有限公司；

辛酸單甘酯(GMC)、月桂酸單甘酯(GML)、硬脂酸單甘酯(GMS)：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

單雙脂肪酸甘油酯(MDG)、單油酸甘油酯(GMO，≥50%，HPLC)、雙油酸甘油酯(GDO，1,3-GDO，1,2-GDO混合體系，90%)：阿拉丁試劑有限公司；

β-胡蘿卜素：>98%，慧科生物科技有限公司；

維生素D(>90%)、黏蛋白、胃蛋白酶(3 000 U/mg)、膽鹽：上海源葉生物科技有限公司；

胰酶：100～500 U/mg，美國(guó) Sigma-Aldrich公司；

其他所用試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速剪切機(jī)：Ultra-TurraxT25型，德國(guó)IKA公司；

高壓微射流：M-110L型，美國(guó)Microfluidics公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，常州國(guó)華電器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：H1850R型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV-1700型，日本島津公司；

激光粒度分析儀：Malvern 2000型，英國(guó)Malvern公司；

納米粒度測(cè)定儀：Zetasizer Nano ZS型，英國(guó)Malvern公司；

激光共聚焦顯微鏡：U-TB04917型，日本OLYMPUS公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳液制備

(1) 水相：將乳清蛋白與磷酸緩沖溶液(PBS 5 mmol/L, pH 7)混合，攪拌2 h后于4 ℃過夜。

(2) 油相：將MDG(或不同結(jié)構(gòu)的MDG)與脂溶性營(yíng)養(yǎng)素(β-胡蘿卜素或維生素D)于55 ℃下水浴攪拌混合，按相應(yīng)比例加入植物油(或MCT)。

(3) 乳化：油相與水相體系攪拌混合，10 000 r/min高速剪切3 min，預(yù)乳化后經(jīng)高壓微射流處理(6.21×107Pa，5次循環(huán))，制備乳液，乳液于4 ℃保存以用于體外消化研究。

1.2.2 體外消化模型 參照文獻(xiàn)[12-13]并修改。

(1) 口腔：3 mL的乳液和4.5 mL PBS(pH 7.0，5 mmol/L)混合，再與7.5 mL模擬唾液[12]混合，用NaOH溶液調(diào)pH至6.8，37 ℃、100 r/min攪拌2 min。

(2) 胃：經(jīng)口腔消化的樣品與模擬胃液[13]按體積比1∶1混合，調(diào)整pH至2.5， 37 ℃、100 r/min下反應(yīng)1 h。

(3) 小腸：將30 mL胃消化樣品pH調(diào)至7.0，加入3.5 mL 膽鹽溶液(53.57 mg/mL)，再加入1.5 mL CaCl2(125 mmol/L)和NaCl(3.75 mol/L)混合溶液，將pH調(diào)為7.0，加入2.5 mL新鮮制備的胰酶懸浮液(24 mg/mL)，采用pH-stat滴定儀使體系pH維持在(7.00±0.02)，保持2 h，記錄消耗的NaOH體積。整個(gè)過程溫度恒定在37 ℃，每個(gè)樣品至少進(jìn)行3次模擬消化試驗(yàn)。

1.2.3 乳液粒徑和電位的測(cè)量 分別采用激光粒度分析儀和納米粒度測(cè)定儀測(cè)定各消化階段乳液的粒徑分布及表面電位，胃階段的樣品使用pH調(diào)至2.5的超純水稀釋至相同油相含量，測(cè)量溫度25 ℃。

1.2.4 乳液微觀結(jié)構(gòu)的變化 1 mL樣品加10 μL尼羅紅(0.01%)熒光染色后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察各階段乳液微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.5 營(yíng)養(yǎng)素的生物可給性測(cè)定 將小腸消化液于25 ℃ 離心(12 000 r/min，30 min)取膠束層。按式(1)計(jì)算營(yíng)養(yǎng)素的生物可給性[14]。

(1)

式中：

B——營(yíng)養(yǎng)素的生物可給性，%；

CMicelle——膠束中營(yíng)養(yǎng)素濃度，g/mL；

CDigesta——小腸消化液中營(yíng)養(yǎng)素的濃度，g/mL。

1.2.6 維生素D含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]。

1.2.7 類胡蘿卜素含量的測(cè)定 取小腸消化液或膠束上清液0.5 mL，加入4.5 mL DMSO，渦旋混勻，測(cè)定465 nm 處吸光值，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為類胡蘿卜素濃度。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDG/PL添加對(duì)維生素D生物可給性的影響

2.1.1 乳液體系消化過程中的粒徑及結(jié)構(gòu)變化 由圖1可知，3種乳液體系表觀均呈均勻的乳白色，粒徑范圍為0.16 μm左右且初始粒徑分布情況相似，說明在嬰兒配方奶粉乳液體系中復(fù)配添加MDG和PL不會(huì)影響乳液體系的表觀性狀。

圖1 3種乳液的初始粒徑分布Figure 1 Initial particle size distribution of three emulsion systems

由圖2可知，3種乳液經(jīng)胃和小腸消化后，粒徑顯著增加。由圖3可知，純WPC構(gòu)建的乳液在胃消化條件下產(chǎn)生較大的絮凝團(tuán)塊，而MDG的添加能減少該現(xiàn)象的發(fā)生，可能是MDG的添加有助于胃蛋白酶在乳液表面的均勻分布，提高乳液在胃部的消化速率，減輕胃部的消化負(fù)擔(dān)。

圖2 3種乳液體系經(jīng)各階段消化后的粒徑分布Figure 2 Particle size distribution changes of three emulsion systems under each digestion site

由圖4可知，復(fù)配添加MDG+PL的乳液體系其乳液粒徑分布與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的母乳經(jīng)消化后的粒徑分布基本一致，均在>100 μm處出現(xiàn)了大量顆粒分布。而僅含有純?nèi)榍宓鞍椎娜橐航?jīng)消化后粒徑分布只在100 μm以內(nèi)有單峰，在消化過程中無大粒徑顆粒的形成。綜上，添加MDG+PL乳化體系使得乳液界面組成與母乳中天然存在磷脂、膽固醇、單雙脂肪酸甘油酯等極性脂質(zhì)[5]組成更為接近，使其在小腸消化條件下，這些母乳中天然存在的極性脂質(zhì)促進(jìn)形成了大粒徑消化物，其粒徑與母乳的更為接近。因此，可推斷添加MDG+PL乳化體系能促使乳液體系消化行為與母乳更為接近。

圖3 3種乳液體系在各消化環(huán)境下的微觀結(jié)構(gòu)Figure 3 Microstructure of three emulsion systems under each digestion site

2.1.2 3種乳液體系中脂肪消化水解及其脂溶性營(yíng)養(yǎng)素生物可給性比較 乳液進(jìn)入小腸后，在胰脂肪酶的作用下，乳液中包埋的甘油三酯逐步水解生成MDG和游離脂肪酸，同時(shí)乳液中的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素被逐漸釋放出來。釋放出的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素可被膽鹽、磷脂及甘油三酯水解生成的游離脂肪酸及MDG形成微膠束進(jìn)行包載，微膠束從小腸腔穿過黏液層轉(zhuǎn)運(yùn)至小腸上皮細(xì)胞表面進(jìn)行吸收[16]。因此微膠束中包載的營(yíng)養(yǎng)素含量可反映乳液體系中營(yíng)養(yǎng)素的生物可給性。

圖4 3種乳液體系經(jīng)胃腸道消化后在小腸中消化物的粒徑分布

由圖5可知，消化初期，復(fù)配添加MDG和PL的乳液體系比純?nèi)榍弩w系乳液消化速率更快，說明MDG和PL的復(fù)配添加能提升甘油三酯的水解速率，促進(jìn)脂溶性營(yíng)養(yǎng)素更快釋放。這可能是MDG和PL等極性脂肪可部分取代乳液顆粒表面在油水界面上分布的蛋白，使得胰脂肪酶更易于脂肪接觸，從而促進(jìn)水解使得乳液體系中的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素更快地釋放進(jìn)入小腸腔中[6]。添加MDG+PL乳液經(jīng)小腸消化后，小腸消化液分離出的膠束層在大粒徑處有更多分布，表明含有MDG+PL乳液消化液中存在更多粒徑較大的微膠束。

圖5 3種乳液體系在小腸消化過程中NaOH的消耗量及消化后膠束的粒徑分布Figure 5 Consumption of NaOH during the small intestine digestion and Micellar particle size distribution after digestion of three emulsion systems

由圖6可知，WPC、WPC+MDG及WPC+MDG與PL乳液中維生素D的生物可給率分別為(75.98±1.98)%，(78.65±0.71)%，(83.18±1.40)%。其中MDG與PL復(fù)配添加組維生素D的生物可給率顯著高于純WPC和WPC+MDG乳液體系(P<0.05)，表明MDG和PL的復(fù)合添加具有顯著提高乳液中脂溶性營(yíng)養(yǎng)素——維生素D生物可給性的作用，而單一添加MDG并不能達(dá)到此效果。結(jié)合膠束層粒徑分布結(jié)果，復(fù)配添加MDG和PL的乳液消化后形成膠束的大小和分布特點(diǎn)均與母乳相似。這可能是在乳液中復(fù)配添加極性脂質(zhì)(MDG和PL)，與母乳乳液中表面膜組分上極性脂質(zhì)組成更為接近，因此有助于形成與母乳類似的、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的、粒徑更大的微膠束結(jié)構(gòu)[17-18]。而較大粒徑的微膠束結(jié)構(gòu)能有效地包載分子結(jié)構(gòu)較大的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素，并能包載更多的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素，促進(jìn)其在小腸中的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，提高其生物可給率[19]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 單雙脂肪酸甘油酯/磷脂(MDG/PL)的添加對(duì)維生素D生物可給率的影響

2.2 MDG組成結(jié)構(gòu)對(duì)乳液中脂溶性營(yíng)養(yǎng)素類胡蘿卜素生物可給性的影響

由圖7可知，對(duì)照組乳液(純WPC乳液)中脂溶性營(yíng)養(yǎng)素β-胡蘿卜素生物可給性最低，為(1.76±0.01)%，而在體系中添加MDG后，脂溶性營(yíng)養(yǎng)素類胡蘿卜素可給性顯著提升(P<0.05)，生物可給性可提升至純WPC乳液體系中類胡蘿卜素生物可給性的8～15倍。相比于維生素D，類胡蘿卜素的生物可給性偏低[14]，而MDG的添加對(duì)提升類胡蘿卜素這種本身在人體中吸收效率較低的脂溶性營(yíng)養(yǎng)素的效果更為顯著。說明不同組成結(jié)構(gòu)的MDG對(duì)脂溶性營(yíng)養(yǎng)素類胡蘿卜素生物可給性的提升效果不同，其提升有效性依次為GMO乳液[(28.58±0.58)%]> GDO乳液[(26.42±0.72)%]> GML乳液[(23.95±1.39)%]> GMS乳液[(16.94±1.66)%]≈GMC乳液[(16.24±1.23)%]。其中，GMO和GDO對(duì)類胡蘿卜素生物可給性的提升效果最為顯著。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 不同組成結(jié)構(gòu)單雙脂肪酸甘油酯(MDG)對(duì)類胡蘿卜素生物可給率的影響

母乳脂肪酸中單不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸(油酸等)占近50%[20]，因此MDG應(yīng)主要以單不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸構(gòu)建的形式為主。試驗(yàn)所選擇的MDG是基于母乳中可能存在的MDG類型，選擇性添加其中占主體的由單不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸構(gòu)建的MDG，包括GMO和GDO。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸酯GMO、GDO對(duì)類胡蘿卜素生物可給性的提升效果最佳。Bettler等[11]研究發(fā)現(xiàn)，相比于母乳，嬰兒對(duì)嬰兒配方粉中類胡蘿卜素類(葉黃素)的吸收率顯著較低，嬰兒配方粉中需添加4倍于母乳含量以達(dá)到相同的吸收效果。

3 結(jié)論

研究基于母乳組成，在嬰兒配方奶粉中復(fù)合添加極性脂質(zhì)成分——單雙脂肪酸甘油酯及磷脂，研究其對(duì)脂溶性營(yíng)養(yǎng)素生物可給性的影響。結(jié)果表明，單雙脂肪酸甘油酯及磷脂新型乳化技術(shù)能促使奶粉的消化過程和消化行為更接近母乳，顯著提高了奶粉中脂溶性營(yíng)養(yǎng)素在人體內(nèi)的生物可給性，促進(jìn)了其在人體中的吸收效率；添加單雙脂肪酸甘油酯/磷脂的乳液在經(jīng)消化后，其小腸中的粒徑分布與母乳的相似，在大粒徑處有較多分布；不同組成結(jié)構(gòu)的單雙脂肪酸甘油酯均能有效提高脂溶性營(yíng)養(yǎng)素的吸收，但對(duì)脂溶性營(yíng)養(yǎng)素的提升效果存在顯著差異，油酸型的單雙脂肪酸甘油酯由于與母乳中天然存在形式更為接近，因此對(duì)脂溶性營(yíng)養(yǎng)素膠束化效率提升效果最佳。后續(xù)將對(duì)單雙脂肪酸甘油酯/磷脂提高脂溶性營(yíng)養(yǎng)素吸收效率的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入分析探討。