不同噴霧干燥入口溫度下雞蛋清差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

劉麗莉 史勝娟 陳 珂 張孟軍 郝威銘 李媛媛

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023;2. 食品加工與安全國家級教學(xué)示范中心，河南 洛陽 471023)

雞蛋清蛋白質(zhì)的氨基酸組成與人體的十分接近，是理想的蛋白質(zhì)來源[1]。雞蛋清中富含鐵、鈣、鋅、鉀和磷等，是對人體健康起關(guān)鍵作用的礦物質(zhì)。另外，因為雞蛋清蛋白占干物質(zhì)的80%以上[2]，具有優(yōu)異的發(fā)泡和凝膠性能等多種功能特性[3]，常被作為制作烘焙產(chǎn)品、蛋白和肉制品的原材料應(yīng)用于食品加工中。

噴霧干燥是指通過將樣品噴入一種熱的干燥介質(zhì)中，熱空氣與液滴迅速接觸，水分瞬間蒸發(fā)，從而可以快速得到脫水產(chǎn)品。由于粉末材料的固有特性，如減少包裝、貯藏和運輸費用，將噴霧干燥作為一種重要的技術(shù)納入蛋清蛋白的生產(chǎn)過程是非常重要的。此外，其干燥接觸時間相對較短(5～100 s)[4]。非標記定量(iTRAQ)技術(shù)具有重復(fù)性高，定量較好等優(yōu)勢。Raikos等[5]將2-DE結(jié)合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用于雞蛋蛋白的分離和鑒定中，成功鑒定出簇蛋白(clusterin)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin)、卵白蛋白(ovalbumin)、thetical protein FIJ 10305和activin receptor type IIA 5種蛋白。Guérin-Dubiard等[6]采用2-DE和質(zhì)譜連用技術(shù)，鑒定出16種蛋白，其中Tenp和VMO-1兩種蛋白首次被發(fā)現(xiàn)，其他的蛋白分別是卵糖蛋白(ovoglycoprotein，又稱alpha 1-acid glycoprotein)、卵白蛋白、卵白蛋白X(ovalbumin-related protein X，OVAX)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、TENP(transiently expressed in neural precursors)及溶菌酶C。Omana等[7]運用組學(xué)的方法研究了雞蛋在貯藏過程中蛋清蛋白質(zhì)組的差異。

蛋白質(zhì)組學(xué)是高通量研究蛋白質(zhì)組最常用的方法，被廣泛應(yīng)用于多個學(xué)科。目前，關(guān)于蛋清粉在不同噴霧干燥入口溫度下差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究尚未見報道。試驗擬以干燥入口溫度140，160，180 ℃的蛋清粉為研究對象，采用iTRAQ技術(shù)構(gòu)建蛋清蛋白在干燥過程中的表達圖譜，分析三者間的差異蛋白質(zhì)組學(xué)變化[8]，旨在更好地了解并篩選出雞蛋清不同干燥溫度過程中影響較大的功能蛋白，為解釋噴霧干燥加工雞蛋清的加工方式和生物功能性質(zhì)等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雞蛋：河南洛陽大商新瑪特超市；

蛋清粉：自制，將蛋白、蛋黃分開，自然發(fā)酵(脫去葡萄糖，使蛋清具有更好的起泡和凝膠性)，60 ℃巴氏殺菌處理4 min，再進行噴霧干燥處理，并于4 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

Modified Trypsin蛋白酶：質(zhì)譜級，美國PROMEGA公司；

NUPAGE 10% BT GEL 1.0MM 12W、Protease Inhibitor Cocktail、Bond-BreakerTMTCEP Solution (TCEP)、PierceTMBCA Protein Assay Kit：美國Thermo Fisher Scientific公司；

iTRAQ 8PLEX、AB SCIEX、IAM碘乙酰胺、氨水：美國Sigma公司；

恒溫混勻儀：TMR型，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；

酶標儀：Varioskan LUX型，賽默飛世爾科技公司；

Q-液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Q-Exactive HF-X型，賽默飛世爾科技公司；

色譜柱：IMAC型，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；

電泳儀：1645052型，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 凝膠電泳的測定

根據(jù)Katekhong等[9]的方法。將樣品與緩沖液混合，煮沸4 min，2 700 r/min離心10 min，將含有20 μg蛋白質(zhì)的每個樣品溶液10 μL裝入單獨的孔中，于恒定電壓(150 V)下電泳45 min，最后將其降解2.5 h。

1.3 iTRAQ技術(shù)測定

1.3.1 樣品處理 將制備好的蛋清粉樣品(每個樣品4 μL，共12 μL蛋清)進行混合并稀釋至12 μL PBS中，用112 μL 98%乙醇沉淀，用胰蛋白酶(即1/50，胰蛋白酶/蛋白質(zhì))切割，37 ℃下過夜。

1.3.2 質(zhì)譜分析 用納米反相柱洗脫肽陽離子。通過電噴霧電離將洗脫的肽陽離子轉(zhuǎn)化為氣相離子，并在熱軌道聚變質(zhì)譜儀上進行分析[10]。在120 k分辨率(m/z200)下，用5×105離子計數(shù)靶對m/z400～1 600的肽前體進行測量掃描。串聯(lián)MS/MS在第1.5天與四極桿分離。動態(tài)排斥持續(xù)時間設(shè)置為45 s。開啟單同位素前體選擇，儀器以最高速度運行，循環(huán)時間為2 s。

1.3.3 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均采用Max Quant Software Reversion 1.5.3.8進行收集和量化。對于蛋白質(zhì)分類，使用在線PANTHER庫。為了在蛋清蛋白中發(fā)現(xiàn)過度表達的基因本體論(GOs)，啟動PANTHER過度表達試驗，用Bonferroni校正對G.gallus(數(shù)據(jù)庫中的所有基因)參考列表和注釋數(shù)據(jù)集進行多次試驗，完成GO分子功能和GO生物過程。

1.3.4 統(tǒng)計分析 分析前，使用自然對數(shù)轉(zhuǎn)換[ylg(x+1)]轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)[11]。首先，對蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集進行組間成分分析(BGA)。BGA通過對組均值進行主成分分析來關(guān)注組間變異性。組間差異的重要性由組間慣性與總慣性之比進行評估。使用蒙特卡羅排列試驗檢查組間差異的統(tǒng)計顯著性。用Monte Carlo排列試驗評價統(tǒng)計學(xué)意義。CIA可以應(yīng)用于變量數(shù)遠遠超過樣本數(shù)的數(shù)據(jù)集。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴霧干燥入口溫度對蛋清蛋白SDS-PAGE的影響

由圖1可知，經(jīng)不同噴霧干燥溫度制得的蛋清粉的蛋白條帶分布大體相似，且蛋白質(zhì)組分變化較小。25～30 kD范圍內(nèi)，25 kDa處對應(yīng)的是卵類黏蛋白，但條帶A、B、C均沒有卵類黏蛋白條帶，可能是由于蛋清液在噴霧干燥前加水稀釋處理或在噴霧干燥過程中，卵黏蛋白等聚集物被除去，所以在電泳圖上并沒有卵類黏蛋白的特征條帶。條帶A、B、C中并沒有新的分子量蛋白質(zhì)生成，說明蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)沒有因為干燥溫度的變化而發(fā)生改變。采用SDS-PAGE對蛋清蛋白進行質(zhì)檢，發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白條帶清晰、無雜質(zhì)，符合后續(xù)試驗要求。

M. Marker A. 140 ℃ B. 160 ℃ C. 180 ℃圖1 3種蛋清粉的SDS-PAGE圖Figure 1 SDS-PAGE of three kinds of egg white powder

2.2 差異表達蛋白質(zhì)的鑒定及統(tǒng)計分析

由表1可知，試驗中共有62種蛋白質(zhì)被定量，且每一對之間差異表達的蛋白質(zhì)組顯示重疊(圖2)，如25個蛋白質(zhì)在160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃之間重疊[12]。以160 ℃與140 ℃的倍數(shù)變化閾值分別為>1.20或<0.83，其中8個蛋白質(zhì)被指定為顯著上調(diào)[13]，而33個蛋白質(zhì)在160 ℃后顯著下調(diào)。同樣的標準(折疊變化閾值>1.20或<0.83)用于選擇180 ℃與140 ℃組顯著變化(P<0.05)的差異蛋白質(zhì)[14]，有18個差異蛋白被認為顯著上調(diào)，而28個差異蛋白在180 ℃后顯著下調(diào)。

2.3 差異表達蛋白質(zhì)聚類分析

通過對140，160，180 ℃組的62個差異蛋白進行層次聚類分析，以揭示蛋白質(zhì)變化的模式[15]，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，3組差異蛋白共得到10個對應(yīng)于不同蛋白質(zhì)變化模式的簇[16]。簇B、E和簇H由干燥溫度140～180 ℃前后差異顯著的蛋白質(zhì)組成。具體來說，180 ℃ 干燥后，簇B、E顯示出10種蛋白質(zhì)的表達量明顯下降，而簇H顯示出13種蛋白質(zhì)在增加。簇F和簇G、C中，與140 ℃組相比，簇F共有5種蛋白質(zhì)在160 ℃組中的表達量過高，但當干燥溫度上升至180 ℃時，這些蛋白質(zhì)表達量顯著降低，與140 ℃組的相當，表明這些蛋白的高豐度可被視為低干燥出粉率的信號[17]。簇G、C共有9個與簇F相反的蛋白質(zhì)組成，預(yù)測這些蛋白質(zhì)在蛋清干燥過程中具有積極作用[18]。簇I和簇A、D在140 ℃組和180 ℃組之間表現(xiàn)出較大差異，但干燥溫度在160 ℃組和180 ℃組之間的蛋白質(zhì)豐度差異不大。蛋白的差異模式有助于篩選與干燥和胚胎發(fā)育相關(guān)聯(lián)的蛋白[19]。

表1 差異蛋白質(zhì)分析結(jié)果統(tǒng)計

圖2 160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃蛋清蛋白粉韋恩圖Figure 2 Venn diagrams of egg white protein powder at 160 ℃ vs 140 ℃ and 180 ℃ vs 140 ℃

圖3 差異表達蛋白質(zhì)聚類分析Figure 3 Results of cluster analysis of differentially expressed proteins

2.4 差異表達蛋清蛋白粉的GO功能注釋分析

綜上可知，160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃兩組蛋清蛋白共鑒定62個差異蛋白，采用生物信息學(xué)軟件對已鑒定到的62個差異表達蛋清蛋白進行分析[20]。使用PANTHER分析在蛋清中檢測到蛋白質(zhì)進行分類，并確定樣本中存在過多的蛋白質(zhì)類別[21]。在20個生物過程和2個分子功能(圖4和表2)中發(fā)現(xiàn)顯著的過表達，且大部分的差異豐富的蛋白質(zhì)與生物過程有關(guān)，例如細胞過程的GO-term反應(yīng)(GO:0009987)、生物調(diào)節(jié)的GO-term反應(yīng)(GO:0065007)和結(jié)合作用的GO-term反應(yīng)(GO:0005488)等的富集度最高，表明參與細胞調(diào)節(jié)和免疫及催化反應(yīng)調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)數(shù)較多[22]。大多數(shù)差異豐度蛋白與親本GO-terms對細胞外區(qū)(GO:0005576)、細胞部分(GO:0044464)和細胞(GO:0005623)等有關(guān)，其參與的蛋白質(zhì)數(shù)較多顯著過度表達，說明了蛋清對細胞的保護作用[23]。此外，在160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃兩組對比中，180 ℃ vs 140 ℃組中的蛋清差異蛋白數(shù)較多，可能是因為溫度差異越大，對蛋白質(zhì)組的差異影響越大。查閱相關(guān)文獻[24]可知，其差異表達蛋白的某些注釋功能與蛋清液是相似的。

A. 細胞過程 B. 生物調(diào)節(jié) C. 單體過程 D. 生物過程調(diào)控 E. 應(yīng)激反應(yīng) F. 代謝過程 G. 多細胞有機體過程 H. 發(fā)展過程 I. 生物過程負調(diào)節(jié) J. 細胞成分組織或生物發(fā)生 K. 胞外區(qū) L. 細胞 M. 細胞器 N. 細胞部分 O. 細胞外區(qū) P. 膜 Q. 薄膜部分 R. 細胞器部分 S. 結(jié)合 T. 分子功能調(diào)節(jié)

表2 差異蛋白的GO術(shù)語和途徑

2.5 差異表達蛋清蛋白粉的KEGG代謝通路分析

由圖5可知，140 ℃ vs 160 ℃后差異蛋白顯著變化與嘌呤代謝(gga00230)、剪接體(gga03040)和mRNA監(jiān)測途徑(gga03015)3條KEGG途徑有關(guān)[25]。140 ℃ vs 180 ℃后差異蛋白顯著變化與mRNA監(jiān)測途徑(gga03015)、煙酸和煙酰胺代謝(gga00760)和脂肪細胞因子信號途徑(gga04920)3條KEGG途徑有關(guān)。6個顯著變化的蛋白被歸類為代謝途徑，而顯著變化的差異蛋白則在溶酶體途徑(gga04142)中富集。大部分差別豐富的蛋白質(zhì)與KEGG途徑(gga04080和gga04142)等有關(guān)[26]，其參與的蛋白質(zhì)間接表達了參與途徑，為進一步分析蛋清粉品質(zhì)提供了較好的支撐[27]。

圖5 160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃蛋清粉的差異蛋白的KEGG通路圖

2.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(PPI)

篩選標準為蛋白質(zhì)互作得分>0.9，共有18種差異表達蛋白(表3)的68種相互作用(圖6)。大部分蛋白質(zhì)被消除，因為相互之間沒有任何聯(lián)系[28]，其中NP_989936.1、NP_001161204.1、NP_001026172.1、NP_990483.1、XP_025006934.1、NP_001077389.1和XP_015148067.1的連接度較高，具有7～11個互作蛋白，主要連接的通路有GO:0009987、GO:0065007、GO:0005488、GO:0005576、GO:0044464、GO:0005623、gga04080、gga03040、gga03015等[29]。

2.7 指示蛋白的篩選

查閱相關(guān)文獻[30]，再結(jié)合分析代謝通路比較組160 ℃ vs 140 ℃、180 ℃ vs 140 ℃兩組間共有的62個差異表達蛋白，從差異蛋白篩選出與蛋清蛋白密切相關(guān)的指示蛋白。由圖7可知，有4種蛋白質(zhì)在噴霧干燥過程中豐度變化顯著，分別是卵白蛋白相關(guān)蛋白Y、卵白蛋白前體、卵類黏蛋白亞型X2及卵類黏蛋白亞型1前體。豐度變化顯著的原因可能是入口干燥溫度或樣品處理時發(fā)生的物理變化造成的。陳珂等[31]研究表明，噴霧干燥工藝會對雞蛋清蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性造成一定的影響。

表3 網(wǎng)絡(luò)互作顯著變化的蛋白質(zhì)

圖6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 Protein interaction network

2.7.1 卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y和卵白蛋白前體 卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y和卵白蛋白前體均屬于卵白蛋白中的一種，其各自的蛋白氨基酸序列高度同源且同屬于一個家族，但其發(fā)揮的作用各不相同；而這些不同與各自特殊的生理生化功能有關(guān)[32]。雞蛋清噴霧干燥過程中，卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y和蛋白前體的豐度發(fā)生顯著變化，很可能是隨著干燥溫度的升高，蛋清卵白蛋白發(fā)生加速降解或卵白蛋白和堿性蛋白在干燥過程中發(fā)生結(jié)合造成的，其具體原因有待驗證。

2.7.2 卵類黏蛋白亞型X2和卵類黏蛋白亞型1前體

卵類黏蛋白亞型X2和卵類黏蛋白亞型1前體均屬于卵類黏蛋白中的一種。卵類黏蛋白是雞蛋清中的主要抗原蛋白之一，同時也是一種蛋白酶抑制劑和多功能的糖蛋白，其占蛋清蛋白的10%左右，并且有著高度同源的氨基酸序列[33]，等電點為4.0～4.6，蛋白分子量約為(28.0±1.5) kD。利用iTRAQ技術(shù)對蛋清蛋白進行鑒定，在雞蛋清蛋白中并沒有鑒定出卵類黏蛋白，但鑒定出卵類黏蛋白亞型X2和卵類黏蛋白亞型1前體，可能是干燥過程中，卵類黏蛋白受溫度的影響導(dǎo)致變性或者降解使這兩種蛋白質(zhì)形成了結(jié)合物或者發(fā)生其他變化，但仍需進一步驗證。

3 結(jié)論

基于非標記定量(iTRAQ)技術(shù)和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)，分析蛋清蛋白在不同噴霧干燥入口溫度的差異表達蛋白質(zhì)，并對其進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，160 ℃ vs 140 ℃和180 ℃ vs 140 ℃兩組中共有62種差異蛋白質(zhì)，其中共同擁有的差異蛋白25個。蛋白質(zhì)層次聚類分析熱圖表明，得到的差異蛋白質(zhì)信息合理。將上述差異蛋白進行生物信息學(xué)分析得出其主要涉及發(fā)育過程、結(jié)合、刺激反應(yīng)、催化、生物調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程和分子功能。由蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析可以得到全面系統(tǒng)的分子層面的細胞活動模型，以便于對分子機制的深入研究。

圖7 二級質(zhì)譜圖Figure 7 Secondary mass spectrum

在不同入口干燥溫度蛋清蛋白差異蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)有4個蛋白質(zhì)變化較為明顯，分別為卵白蛋白相關(guān)蛋白-Y、卵白蛋白前體、卵類黏蛋白亞型X2和卵類黏蛋白亞型1前體，在功能注釋、信號通路和蛋白質(zhì)互作中變化顯著。因此，這4個差異蛋白質(zhì)均有望作為蛋清蛋白干燥過程中的指示蛋白。