酸性橙II純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

周瑾艷，黃彥捷，許俊斌，黃梓宸，陳 玲，林 鏗，花秀兵，王世超

(廣東省計(jì)量科學(xué)研究院，廣東 廣州 510405)

1 引 言

食品成分分析是用化學(xué)方法對(duì)食品中含有的各種物質(zhì)進(jìn)行分析，包含食品內(nèi)源成分、食品添加劑和污染物等的無(wú)機(jī)成分及有機(jī)成分進(jìn)行分析。近年來(lái)，由濫用食品添加劑和非法添加非食用添加劑而引起的食品安全事件屢見(jiàn)不鮮，食品安全問(wèn)題引起了世界各國(guó)政府的關(guān)注。食品成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為一種可溯源性工具，廣泛應(yīng)用于食品添加劑市場(chǎng)的治理和規(guī)范，是保證分析結(jié)果正確和可靠的重要支撐[1]。然而，由于我國(guó)食品工業(yè)起步較晚，市面上適用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類尚顯不足，并且研發(fā)成本也不低于國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的銷售價(jià)格。在食品安全問(wèn)題日益成為社會(huì)焦點(diǎn)的今天，如何更好地促進(jìn)食品及食品添加劑行業(yè)的健康有序發(fā)展，有效保障廣大消費(fèi)者的健康和權(quán)益，嚴(yán)格控制食品添加劑的過(guò)度使用，嚴(yán)厲打擊食品中非法添加非食用物質(zhì)的行為，是擺在我們面前的重大課題。我國(guó)已制定公布303部食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，覆蓋6 000余項(xiàng)食品安全指標(biāo)。這就要求國(guó)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)機(jī)構(gòu)開(kāi)發(fā)出一系列質(zhì)量可靠、價(jià)格低廉的食品成分分析國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

食品成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過(guò)程通常包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的制備、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、定值、不確定度評(píng)定及比對(duì)和驗(yàn)證等幾個(gè)程序[2，3]。每道程序均需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)過(guò)程、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和嚴(yán)密的結(jié)果計(jì)算。在食品成分中，無(wú)機(jī)物成分包括水和無(wú)機(jī)質(zhì)兩種，有機(jī)物成分則包括色素成分、香氣成分、呈味成分等。相對(duì)而言，分析食品成分中的有機(jī)成分的難度高于分析無(wú)機(jī)成分。有機(jī)成分的分析主要包括主成分定性分析和結(jié)構(gòu)鑒定，純度和含量測(cè)定[4]。有機(jī)物化學(xué)純度的測(cè)定可以通過(guò)兩種方法實(shí)現(xiàn)：(1) 直接測(cè)試主成分含量方法，主成分含量即為純度值，主要通過(guò)色譜法、凝固點(diǎn)下降法、差示掃描量熱法、定量核磁共振法、元素分析法、滴定法等手段實(shí)現(xiàn)；(2) 雜質(zhì)扣除法即質(zhì)量平衡法，測(cè)量所有可能的雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從100%中扣除這些測(cè)得的雜質(zhì)百分含量，即為純度值[5]。有機(jī)雜質(zhì)的測(cè)定多采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[6]，有時(shí)也采用薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、氣相色譜法(gas chromatography, GC)等方法。高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法(HPLC-UV/Vis)可實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)有機(jī)物的檢測(cè)，有些對(duì)紫外無(wú)響應(yīng)的有機(jī)雜質(zhì)則可采用通用性檢測(cè)器如電霧檢測(cè)器(CAD)等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。

本文選取的酸性橙Ⅱ是一種化工色素，工業(yè)上主要用于皮革、羊毛、紙張、蠶絲、錦綸等染色。食品工業(yè)中，酸性橙Ⅱ并不屬于食用色素；因?yàn)槿嗽谑秤盟嵝猿娶蚝髸?huì)引起食物中毒，長(zhǎng)期食用甚至?xí)掳?，因此被明令禁止添加[7]。但一些不法商販利用其色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，為求牟利非法生產(chǎn)與加工，從而嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康。因此研制酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于食品行業(yè)相關(guān)分析方法的評(píng)價(jià)和相應(yīng)儀器的校準(zhǔn)就顯得尤為重要和迫切。

本文將介紹利用經(jīng)典的質(zhì)量平衡法研制GBW(E)100373酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的過(guò)程，重點(diǎn)介紹研制過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的制備、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、定值、不確定度評(píng)定及比對(duì)和驗(yàn)證。

2 質(zhì)量平衡法

質(zhì)量平衡法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析具有較高的準(zhǔn)確度，被世界衛(wèi)生組織(WHO)[8，9]、歐洲藥典[10]推薦為藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法，成為有機(jī)物純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的常用手段。有機(jī)物純度物質(zhì)的主要雜質(zhì)有與主成分結(jié)構(gòu)類似的有機(jī)雜質(zhì)、水分、殘留溶劑和不揮發(fā)性雜質(zhì)等[5]。測(cè)定過(guò)程中，質(zhì)量平衡法克服了由于主成分和各類雜質(zhì)理化性質(zhì)不同，引起儀器響應(yīng)值的差異，從而無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定雜質(zhì)含量的缺點(diǎn)。同時(shí)，該方法通過(guò)分析盡可能存在的雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度的純度定值[11]。

2.1 與主成分結(jié)構(gòu)類似的有機(jī)雜質(zhì)分析方法

主成分及其結(jié)構(gòu)類似的有機(jī)雜質(zhì)可采用色譜法或其聯(lián)用技術(shù)同時(shí)進(jìn)行分析。色譜法分為液相色譜法和氣相色譜法，及其后續(xù)不同聯(lián)用技術(shù)法。通常采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法或二極管陣列檢測(cè)器法(HPLC-UV/Vis或HPLC/PDA)針對(duì)包含紫外/可見(jiàn)吸收發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行分析；采用氣相色譜氫火焰法(GC/FID)分析揮發(fā)性和半揮發(fā)性的有機(jī)化合物。黃亮等[12]采用液相色譜-二極管陣列法分析了肌酐純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)試了水分、灰分、揮發(fā)性物質(zhì)和無(wú)機(jī)元素含量，并采用定量核磁共振法對(duì)其定值進(jìn)行比對(duì)[13，14]；馬康等[15]采用了氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)對(duì)1，2，3，4-四氯苯中的非揮發(fā)性雜質(zhì)用進(jìn)行定性，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)添加的方式確認(rèn)雜質(zhì)為1，2，3，5-四氯苯，并用氣相色譜電子捕獲檢測(cè)器(GC-ECD)對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量；徐鵬等[16]深入研究并優(yōu)化了高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法(HPLC-DAD)與氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器法(GC-FID)對(duì)氯菊酯主成分的定值方法。

2.2 水分分析方法

有機(jī)物的水分分析對(duì)其純度定值至關(guān)重要，由于大部分高純有機(jī)物水分含量較低，因而對(duì)分析方法的靈敏度和精密度要求較高，常見(jiàn)的有卡爾費(fèi)休法和熱重法。其中熱分析技術(shù)是通過(guò)加熱使樣品水分蒸發(fā)，用熱重(thermogravimetric analysis，TG)曲線監(jiān)測(cè)蒸發(fā)的水分重量。該方法簡(jiǎn)單直觀，但要求樣品在分析溫度范圍內(nèi)中不發(fā)生分解；同時(shí)，有些不易逸出的結(jié)晶水和易揮發(fā)性溶劑，均可能影響水分含量的測(cè)定結(jié)果。Yazgan等[17]采用熱重-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)全面分析了熱失重過(guò)程中逸出的水分、降解產(chǎn)物和易揮發(fā)性物質(zhì)。

除了卡爾費(fèi)休滴定之外，根據(jù)水測(cè)定原理，也可通過(guò)蒸餾將水與樣品物理分離，利用色譜法、烤箱紅外線、微波干燥等方法測(cè)定水分含量；但需要大型實(shí)驗(yàn)設(shè)備，且由于樣品中常存在揮發(fā)性雜質(zhì)，因此這些方法存在很大的局限性。由于水分含量會(huì)影響樣品的物理性質(zhì)，因而也可以通過(guò)光密度、極化、折射或電氣方法來(lái)確定[18]，但也不普遍適用。

2.3 揮發(fā)性有機(jī)物分析方法

有機(jī)物純度物質(zhì)在合成和提純工藝中會(huì)存在溶劑殘留，屬于揮發(fā)性有機(jī)物。世界衛(wèi)生組織(WHO)將揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)定義為熔點(diǎn)低于室溫、沸點(diǎn)范圍在50～260 ℃之間的揮發(fā)性有機(jī)化合物。檢測(cè)VOCs常用的方法有氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、離子遷移譜和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜法[20]。氣相色譜是一種常用的VOCs分析方法，可用于痕量和痕量組分的定量。檢測(cè)過(guò)程分為：收集氣體樣品、預(yù)處理、富集、氣相色譜分離，然后使用合適的檢測(cè)器(FID，MS等)進(jìn)行檢測(cè)。馬康等[15]采用頂空GC-MS分析1，2，3，4-四氯苯中的溶劑殘留，確定為乙醚，采用GC-FID對(duì)其準(zhǔn)確定量。

2.4 不揮發(fā)性雜質(zhì)分析方法

不揮發(fā)性雜質(zhì)主要包括灰分和無(wú)機(jī)雜質(zhì)。常用灼燒法和熱重分析測(cè)定灰分，電感耦合等離子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma，ICP)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)測(cè)定無(wú)機(jī)雜質(zhì)。ICP-MS因其靈敏度優(yōu)異、檢測(cè)下限低、動(dòng)態(tài)線性范圍寬，成為目前痕量和超痕量無(wú)機(jī)元素的主要分析手段[21];通常采用熱重分析和灼燒殘留法測(cè)試灰分，作為驗(yàn)證。黃亮等[12]采用ICP-MS分析測(cè)定肌酐中73種無(wú)機(jī)元素的含量，總和為0.012%；同時(shí)用灰分熱重法(TGA)進(jìn)行灼燒，測(cè)定灰分總和為0.025%。

3 酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的研制

3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的提純及分裝

使用市售的高純度酸性橙Ⅱ作為原料，用乙醇作為溶劑溶解，重結(jié)晶提純，過(guò)濾晶體，并在105 ℃下干燥。過(guò)篩，混合并干燥后，置于裝有五氧化二磷的干燥器中干燥24 h，備用。

樣品經(jīng)采用液相色譜-PAD檢測(cè)法進(jìn)行初步均勻性檢驗(yàn)后，分裝于5 mL的棕色樣品瓶中，每瓶裝200 mg，擰緊瓶蓋后，用封口膜密封瓶口，置于低溫(4 ℃)避光保存，一次分裝400瓶。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的定性分析

對(duì)于有機(jī)分子，通?？梢圆捎眉t外光譜、核磁共振、元素分析或是質(zhì)譜的方式對(duì)其主要成分進(jìn)行分析。其中，紅外光譜是通過(guò)分子的特征官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)，觀察其光譜中特定吸收/投射率的位置和強(qiáng)度，從而進(jìn)行定性分析；而核磁共振常用1H譜和13C譜，通過(guò)不同原子的化學(xué)位移、偶合常數(shù)、積分面積等參數(shù)，推測(cè)分子中H原子或C原子所處的化學(xué)環(huán)境及相對(duì)數(shù)目；質(zhì)譜主要通過(guò)尋找分子離子峰或特征碎片峰來(lái)定性分析相對(duì)分子質(zhì)量；元素分析則可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)成分中的C、H、O、S、P、F、Cl、Br等元素的準(zhǔn)確定量。

圖1給出了酸性橙Ⅱ純度候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紅外光譜，可以從位于1 100～1 300 cm-1的芳環(huán)骨架振動(dòng)，及1 500～1 750 cm-1的雙鍵(N=N，S=O)振動(dòng)進(jìn)行定性分析，并通過(guò)和(spectral database for organic compounds，SDBS)數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)，從而確定候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)確實(shí)為酸性橙Ⅱ。

圖1 酸性橙Ⅱ純度候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紅外譜圖Fig.1 Infrared spectrum of acid orange Ⅱ

圖2給出了酸性橙Ⅱ純度候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的核磁共振H譜，從化學(xué)位移上可以分析出H原子分別位于芳環(huán)C上及羥基O上。另外在高分辨質(zhì)譜中可以發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比m/z=327.044的特征峰(脫去Na+)。

圖2 酸性橙Ⅱ純度候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的核磁共振H譜Fig.2 Nuclear magnetic resonance H spectrum of acid orange Ⅱ

3.3 均勻性檢驗(yàn)

通常采用方差分析法來(lái)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)樣品的均勻性。從已經(jīng)分裝好并編上號(hào)碼的酸性橙Ⅱ純度樣品中按照頭尾、中間編號(hào)各隨機(jī)抽取15瓶樣品。準(zhǔn)確稱量抽取的樣品約10 mg，配制成溶液，采用液相色譜-面積歸一化法，在95%的置信概率下采用方差分析考察樣品的均勻性(ISO導(dǎo)則35)，每瓶樣品平行進(jìn)樣3次，3次測(cè)量的平均值作為均勻性評(píng)價(jià)的結(jié)果，然后對(duì)其進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果列于表1。

表1 酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性結(jié)果方差分析Tab.1 The homogeneity and variance analysis results of acid orange reference material

表中：SS表示均值偏差的平方和；df為自由度；MS為平均方差；F為F值，是方差分析得到的統(tǒng)計(jì)量，用來(lái)檢驗(yàn)回歸方程是否顯著；Fcrit為F臨界值。

F

3.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

穩(wěn)定性分為長(zhǎng)期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性。其中長(zhǎng)期穩(wěn)定性是指被定值的特性量隨時(shí)間變化的情況，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性受物理、化學(xué)和保存條件等因素的影響；而短期穩(wěn)定性又稱運(yùn)輸穩(wěn)定性，是為了考察運(yùn)輸條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性影響。

3.4.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性

按照前密后疏的原則，對(duì)酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行了長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察，為期30個(gè)月，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

考察穩(wěn)定性采用液相色譜法，應(yīng)用面積歸一化法，在不同的時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行比對(duì)測(cè)量，每次隨機(jī)抽取3瓶樣品進(jìn)行平行測(cè)量，取平均值作為穩(wěn)定性考察結(jié)果，分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，

|b1|

由于|b1|

表2 酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性Tab.2 Long-term stability test of acid orange Ⅱ reference material

表3 酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果Tab.3 Long-term Stability Variance Analysis Results of Acid Orange Reference Material

表中：b0為穩(wěn)定性數(shù)據(jù)回歸曲線的截距；b1為曲線的斜率；s(b1)為斜率的不確定度；t0.95，n-2為自由度是n-2和p=0.95(95%置信水平)時(shí)的t因子。

3.4.2 短期穩(wěn)定性

為了考察運(yùn)輸條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性影響，并綜合考慮到南方的高溫天氣，實(shí)驗(yàn)?zāi)M了運(yùn)輸條件，隨機(jī)抽取6瓶樣品，分別置于(60±5)℃的培養(yǎng)箱中(運(yùn)輸條件下)和(4±1)℃(常規(guī)儲(chǔ)存條件下)保存一個(gè)星期，對(duì)比兩種不同條件對(duì)其穩(wěn)定性影響(以測(cè)量溫度60 ℃為例)。

對(duì)兩種條件下的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行同樣的統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果見(jiàn)表4，可以發(fā)現(xiàn)兩種條件下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值沒(méi)有發(fā)生顯著變化。

表4 酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果Tab.4 Analysis of short-term stability variance of acid orange Ⅱ reference material (%)

通過(guò)長(zhǎng)期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性考察，在30個(gè)月的長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)，酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性良好，量值沒(méi)有發(fā)生明顯變化，該儲(chǔ)存條件和運(yùn)輸條件很好地保證了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。

3.5 定值

3.5.1 主成分純度確定

酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用質(zhì)量平衡法定值純度。聯(lián)合8家實(shí)驗(yàn)室采用液相色譜紫外檢測(cè)器法對(duì)主成分純度進(jìn)行測(cè)定。每家實(shí)驗(yàn)室儀器使用前均通過(guò)法定計(jì)量機(jī)構(gòu)檢定合格，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室從全部樣品中隨機(jī)抽取3個(gè)包裝，從每瓶中任意取出1～3個(gè)子樣，用色譜級(jí)甲醇當(dāng)溶劑配制測(cè)試液，使用液相色譜法測(cè)量酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。定值結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值結(jié)果Tab.5 Characterization of acid orange purity reference material in 8 laboratories (%)

3.5.2 定值結(jié)果的檢驗(yàn)

(1) 采用狄克遜準(zhǔn)則來(lái)分析上述數(shù)據(jù)。按從小到大排列順序?yàn)椋?/p>

99.12<99.42<99.55<99.59<99.61<99.62<99.91<99.95

因n=8，則

(1)

(2)

查表得D(a，n)=0.608，因此r8

(3)

查格拉布斯準(zhǔn)則臨界值G(0.05，8)=2.032，

1.825

(4)

因此，說(shuō)明該組數(shù)據(jù)無(wú)異常值。

(3) 采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)方法在SPSS軟件中對(duì)8家實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，每家實(shí)驗(yàn)室3組數(shù)據(jù)，共有數(shù)據(jù)24組，結(jié)果如表6所示。

表6 8家實(shí)驗(yàn)室定值結(jié)果正態(tài)分布分析結(jié)果Tab.6 Normal distribution result of value data in 8 laboratories

圖3為8家實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)正態(tài)分布圖。從表6和圖3可以看出：K-S檢驗(yàn)中，漸近顯著性(雙側(cè))即P值為1.000，大于0.05，因此數(shù)據(jù)近似正態(tài)分布。

圖3 8家實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)正態(tài)分布圖Fig.3 Normal distribution map of value data in 8 laboratories

(4) 采用科克倫(Cochran)法檢查8家實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)之間是否為等精度。

計(jì)算8家實(shí)驗(yàn)室3次平行測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差S，按從小到大排列，取最大值Smax，按公式(5)計(jì)算：

(5)

計(jì)算得到C=0.358 5，此時(shí)m=8，n=3，α=0.05,查表得Cα=0.515 7；故C

故而可以采用8家實(shí)驗(yàn)室的總平均值作為聯(lián)合定值的結(jié)果。總平均值如下：

(6)

3.5.3 主成分含量核驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用通用型電霧檢測(cè)器(CAD)對(duì)酸性橙Ⅱ純度進(jìn)行驗(yàn)證。得到主成分含量>99.6%，與紫外檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果一致。

3.5.4 雜質(zhì)含量測(cè)試

采用液相色譜-面積歸一化法測(cè)定酸性橙Ⅱ的純度時(shí)，結(jié)果并不包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可能含有的水分、溶劑殘留和灰分，因此還需要進(jìn)行雜質(zhì)含量測(cè)試。

(1) 水分測(cè)定：酸性橙Ⅱ純度物質(zhì)水分測(cè)試?yán)每栙M(fèi)休水分測(cè)定儀，重復(fù)測(cè)量6次，采用狄克遜準(zhǔn)則分析數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)無(wú)可疑數(shù)據(jù)。全部數(shù)據(jù)予以保留，取平均值0.19%作為水分測(cè)試結(jié)果(極差R=0.13%)。

(2) 殘留溶劑測(cè)定：酸性橙Ⅱ純品原料在加工過(guò)程中，易殘留的溶劑為乙醇，采用頂空進(jìn)樣-氣相色譜儀法對(duì)酸性橙Ⅱ和乙醇進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在頂空條件下，酸性橙Ⅱ溶液中未檢出乙醇等溶劑。

(3) 灰分測(cè)定：酸性橙Ⅱ純度物質(zhì)殘?jiān)ㄟ^(guò)高溫灼燒測(cè)得，稱取適量樣品，在(650±50)℃的馬弗爐中灼燒至恒重，稱重測(cè)得結(jié)果，重復(fù)6次測(cè)量，采用狄克遜準(zhǔn)則分析數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)無(wú)可疑數(shù)據(jù)。取平均值0.23%作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果(極差R=0.15%)。

3.5.5 質(zhì)量平衡法最終定值結(jié)果

根據(jù)質(zhì)量平衡法即扣除雜質(zhì)法：

p=[100%-wnvi]×[100%-wrs-wwater-wash]

=99.60%×(100%-0.19%-0%-0.23%)

=99.2%

(7)

式中：wnvi為非揮發(fā)性雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù);wrs為殘留溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；wwater為水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；p為純度；wash為灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；p為純度。

3.6 不確定度的評(píng)定

根據(jù)《JJG 1006-94一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)值的總不確定度由3部分組成：第1部分是酸性橙Ⅱ定值實(shí)驗(yàn)引入的不確定度uw；第2部分是樣品不均勻產(chǎn)生的不確定度ubb；第3部分是樣品不穩(wěn)定產(chǎn)生的不確定度uits[22～25]。

3.6.1 定值實(shí)驗(yàn)引入的不確定度

定值實(shí)驗(yàn)引入的不確定度由聯(lián)合定值產(chǎn)生的不確定度及水分和殘?jiān)鼘?shí)驗(yàn)引入的不確定度等幾部分組成。根據(jù)ISO Guide 35[3]，多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值的不確定度可采用方差分析來(lái)進(jìn)行估算。定值結(jié)果單因素方差分析得到的結(jié)果列于表7。

表7 定值結(jié)果單因素方差分析Tab.7 The variance analysis results of basic orange reference material

總平均值的不確定度如下計(jì)算：

(8)

式中：sr為組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差；MSwithin為組內(nèi)均方差。

(9)

式中：sL為組間標(biāo)準(zhǔn)偏差；MSamong為組間均方差；n為測(cè)量次數(shù)。

(10)

式中：uLC為液相色譜法定值引入的不確定度。

而根據(jù)水分測(cè)量的數(shù)據(jù)，測(cè)定的R=0.13%，n=6(查表c=2.53)，采用極差法計(jì)算水分引入的不確定度分量為：uwater=R/c=0.05%。根據(jù)灰分測(cè)量的數(shù)據(jù)，測(cè)定的R=0.15%，n=6(查表c=2.53)，采用極差法計(jì)算灰分引入的不確定度分量為：uash=R/c=0.06%。最終：

(11)

3.6.2 均勻性引入的不確定度

均勻性采用酸性橙Ⅱ的純度為比較參數(shù)，樣品瓶間不均勻性所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差必須并入到總的不確定度中。根據(jù)表1均勻性分析結(jié)果可知，樣品間不均勻的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

(12)

ubb≈0.067 3%

3.6.3 穩(wěn)定性引入的不確定度

根據(jù)酸性橙Ⅱ長(zhǎng)期穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及回歸方差結(jié)果可知分由穩(wěn)定性結(jié)果分析可知，有效期t=30 月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的不確定度貢獻(xiàn)即為：

uits=s(b1)·t=8.1×10-3×30=0.243%

(13)

3.6.4 合成擴(kuò)展不確定度

合成各部分不確定分量：

=0.282%

(14)

擴(kuò)展不確定度：

U=k×u=2×0.282%=0.56%≈1.0%

(15)

酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果為：W=(99.2±1.0)%，k=2。

3.7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比對(duì)和驗(yàn)證

研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過(guò)程中，需對(duì)定值結(jié)果或測(cè)量方法進(jìn)行國(guó)際、國(guó)內(nèi)比對(duì)或測(cè)量驗(yàn)證工作。目前，國(guó)內(nèi)外酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品主要有純度和溶液兩種類型 ，多用于食品、化妝品等產(chǎn)品中酸性橙Ⅱ的檢測(cè)。表8列出了部分國(guó)內(nèi)外酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)情況及比對(duì)結(jié)果。

表8 酸性橙Ⅱ純度和溶液同類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況對(duì)照表Tab.8 Comparison of purity and solution of acid orange Ⅱ reference materials

選用Dr. Ehrenstorfer?GmbH 的C1573500與本文GBW(E)100373標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比對(duì)分析，將兩種純度物質(zhì)配制相應(yīng)濃度的溶液進(jìn)行液相色譜純度分析。結(jié)果表明使用進(jìn)口的純度標(biāo)準(zhǔn)品單點(diǎn)校正測(cè)定廣東省計(jì)量科學(xué)研究院研制的酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其值均落在定值的不確定度范圍，因此GBW(E)100373酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值是可信的，且具有穩(wěn)定、便捷的特點(diǎn)。

4 結(jié) 論

以經(jīng)典的質(zhì)量平衡法研制了GBW(E)100373酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，重點(diǎn)介紹了研制過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的制備、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、定值、不確定度評(píng)定及比對(duì)和驗(yàn)證，是食品成分中有機(jī)成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的一個(gè)典型代表。 酸性橙Ⅱ純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以滿足食品、醫(yī)藥、日?；瘜W(xué)品、環(huán)保、化學(xué)產(chǎn)品研究和測(cè)試需求，也將用于對(duì)相關(guān)儀器(例如比色板、熒光分光光度計(jì)等)校準(zhǔn)和分析方法的評(píng)估。未來(lái)，期待研制出更多食品成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，促進(jìn)食品及食品添加劑行業(yè)的健康有序發(fā)展，為保障廣大消費(fèi)者的健康而做出貢獻(xiàn)。