HPLC法測定活血壯筋丸中血竭素的含量測定

河南省許昌市食品藥品檢驗檢測中心（461000）潘彥榮 王爽 劉艷霞 常曉平

活血壯筋丸為常用的中成藥，由制川烏、紅花、血竭、乳香（去油）、沒藥（去油）、土鱉蟲、地龍、全蝎、川牛膝、桂枝、人參等十一味藥材組成，具有祛風(fēng)活血，強(qiáng)腰壯筋的功效，用于筋骨疼痛，半身不遂等癥狀。根據(jù)本品的功能主治和處方組成，為了有效控制本品質(zhì)量，選擇處方中主藥血竭的主要成分血竭素作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)成分。采用HPLC法對該藥中的血竭素進(jìn)行了含量測定研究。其方法簡便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為本制劑質(zhì)量控制提供了可靠的定量方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津 UV2600Ⅱ型紫外分光檢測器，沃特世e2695高效液相色譜儀，賽多利斯MSA225S-000-DU電子天平。

1.2 試藥 血竭素（110811-201707）（中國藥品生物制品鑒定研究院），活血壯筋丸供試樣品（市場購買），乙腈（德國默克色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。

附圖1 血竭素吸收光譜

附圖2 1、血竭素吸收色譜，2、活血壯筋丸中血竭素吸收色譜，3、陰性色譜

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件（避光操作） 測定波長的選擇：取血竭素對照品溶液（33.5221μg/ml）和陰性對照溶液，在250～460nm進(jìn)行掃描，結(jié)果對照品溶液光譜最大吸收峰分別位于270.0nm和440.0nm。參照《中國藥典》[1]2015年版一部血竭的含量測定，選擇440nm作為本品的測定波長。結(jié)果陰性對照無干擾見附圖1。

附圖3 血竭素吸收色譜

附圖4 活血壯筋丸中血竭素吸收色譜

附圖5 陰性色譜

附圖6 1：江申柱；2：GL柱；3：Welch Materials柱；4：島津150mm柱。

色譜柱：江申CenturySIL C18-EPS柱（250×4.6mm，5μm），乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液（50∶50）為流動相；柱溫30℃；檢測波長為440nm。在選定的色譜條件下，血竭素和樣品中其他組分色譜峰可達(dá)到基線分離，血竭素與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于4000，見附圖2。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品（中國藥品生物制品檢定所 批號110811-201707）11.54mg，置50ml的棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml置25ml棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得（血竭素重量=血竭素高氯酸鹽/1.377），制成每1ml含血竭素33.5221μg，見附圖3。

2.3 樣品溶液制備 取裝量差異下的本品內(nèi)容物約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入3%磷酸甲醇溶液25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率360W，頻率40kHz）10分鐘，取出，放置至室溫，再稱定重量，用3%磷酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，即得，見附圖4。

2.4 陰性對照液的制備 按照處方比例制備缺血竭的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液，見附圖5。

2.5 檢測限 用信噪比法測定，血竭素的檢測限為3.3×10-4μg。

2.6 定量限 用信噪比法測定，血竭素的定量限為1.0×10-3μg。

2.7 線性考察 精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品（血竭素重量=血竭素高氯酸鹽/1.377），加3%磷酸甲醇溶液制成每1ml含血竭素33.5221μg的溶液，精密吸取對照品溶液各1、2、5、10、15、20μl，分別注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見附表1。血竭素：線性范圍33.5221～670.442ng；工作方程Y＝2182.622X-3811.553，γ=0.99998

2.8 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，連續(xù)測定6次，結(jié)果見附表2。結(jié)果表明，本方法精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一批號（批號：180101）供試品溶液，分別在第0、2、4、6、8、10、12小時進(jìn)樣1次，每次進(jìn)樣10μl，測定其峰面積，結(jié)果見附表3。結(jié)果表明，血竭素對照品溶液在12小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 提取完全性考察 原標(biāo)準(zhǔn)中血竭素高氯酸鹽的測定方法中，樣品提取采用的方法是振搖提取，參考相關(guān)研究資料[2-5]，且鑒于振搖提取受影響因素較多，誤差較大，故采用超聲提取作為供試品的提取方法。同時，對提取時間也進(jìn)行了考察。考察了10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘五個不同提取時間，結(jié)果表明超聲提取30分鐘提取效率最高，故選擇30分鐘的提取時間，具體見附表4。

2.11 重復(fù)性試驗 取樣品（批號180101）分為三組，Ⅰ取樣量約0.6g，Ⅱ取樣量約1g，Ⅲ取樣量約1.5g，每組分別稱取6份，共計18份，按照上述含量測定方法測定血竭素含量，測定結(jié)果見附表5。

2.12 回收率試驗 取已知含量的本品（批號180101，血竭素含量0.25mg/粒）內(nèi)容物約1g，精密稱定，稱取6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入血竭素高氯酸鹽3%磷酸甲醇溶液（14.9964μg/ml）25ml，稱定重量，超聲處理（功率360W 頻率40kHz）30分鐘，取出，放置至室溫，再稱定重量，用3%磷酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。精密吸取對照品溶液及供試品溶液10μl，分別注入液相色譜儀，照正文含量測定項下的方法測定血竭素含量，計算回收率，結(jié)果見附表6。

2.13 樣品測定 本品5批，按照正文含量測定項下的方法測定血竭素含量，結(jié)果見附表7。

2.14 不同商品規(guī)格的色譜柱試驗 考察了四根不同商品規(guī)格的色譜柱(色譜柱：①江申：CenturySIL C18-EPS柱（250×4.6mm，5μm）；②GL Sciences：Wonda Sil C18柱（4.6×250mm，5μm）；③Welch Materials：Ultimate XB-C18柱（250×4.6mm，5μm）；④島津：Shimpack VP-ODS柱（150×4.6mm，5μm）)，分別測定同一對照品溶液和同一供試品溶液（批號180101），具體結(jié)果見附表8，圖譜見附圖6。

附表1 線性關(guān)系考察

附表2 精密度試驗

附表3 穩(wěn)定性試驗

附表4 提取方法選擇

附表5 重復(fù)性測定結(jié)果

附表6 回收率試驗

附表7 樣品含量測定結(jié)果

附表8 不同商品規(guī)格的色譜柱測定結(jié)果

3 討論

3.1 波長的選擇 選用紫外分光光度法（UV）在波長250～460nm對血竭素對照品溶液進(jìn)行掃描，對照品溶液在位于270.0nm和440.0nm有最大吸收。參照《中國藥典》2015年版一部血竭的含量測定，故采用該波長440nm為高效液相色譜法的檢測波長。

3.2 色譜柱的選擇 為了考察活血壯筋丸血竭素含量測定方法中不同色譜柱中的穩(wěn)定性，選擇了四根不同商品規(guī)格的色譜柱，分別對同一對照品溶液和同一供試品溶液進(jìn)行測試，測試結(jié)果RSD≤2%，證明該方法的可行性、科學(xué)性、先進(jìn)性。

3.3 抗干擾 通過查閱相關(guān)資料進(jìn)行方法驗證[6][7][8]，經(jīng)過反復(fù)試驗，用上述試驗結(jié)果充分證明該方法耐用性試驗良好。血竭素峰理論板數(shù)參照《中國藥典》2015年版一部血竭含量測定項下規(guī)定，不得低于4000。為了考察干擾組分的干擾情況，分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照液各10μl，注入色譜儀。記錄色譜圖，結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜相同保留時間有對應(yīng)的峰，陰性對照液無對應(yīng)峰。在本次實驗過程中，本著節(jié)能環(huán)保的理念。既要保證藥品質(zhì)量，又要保證該方法的可行性，故采用此方法。