張飛龍,楊衛(wèi)華,陳明亮,嚴燕兵,唐云平,肖延銘
(1.長興制藥股份有限公司 工業(yè)生物催化與轉化浙江省工程研究中心,浙江 長興 313100;2.浙江海洋大學 食品與醫(yī)藥學院,浙江 舟山 316022)
度魯特韋是人類免疫缺陷病毒類型I(HIV-1)整合酶鏈轉移抑制藥,其化學合成所需原料較多,(R)-3-氨基丁醇是其重要原料之一,(R)-3-氨基丁酸(R-3-ABA)主要作為醫(yī)藥中間體(R)-3-氨基丁醇的前體物[1-2]。目前,國內(nèi)對于(R)-3-氨基丁醇的制備主要還是傳統(tǒng)的化學方法,包括:化學拆分法、化學誘導法、手性原料合成法和制備色譜法等。但采用以上方法制備(R)-3-氨基丁醇易對環(huán)境造成較大的污染且收率不高,不利于節(jié)能減排[3-4]。開發(fā)具有高效、低成本的路線合成高純度的(R)-3-氨基丁酸是降低度魯特韋原料藥成本、推廣其應用范圍的關鍵步驟。相對于化學法,利用生物酶法催化技術建立一個低成本、高效、環(huán)保,且制備工藝簡單,有利于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝將具有更加廣泛的應用前景。
天冬氨酸酶,也稱天冬氨酸裂氨酶(EC 4.3.1.1,Asp),是特異于天冬氨酸或其衍生物為底物的3種類型的氨裂解酶之一,在氮代謝中起著重要的作用,通過催化L-天冬氨酸可逆地消除氨并產(chǎn)生富馬酸鹽[5-6]。目前研究的幾種相關的天冬氨酸酶包括大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌和芽孢桿菌YM55-1。其中研究最多的是大腸桿菌天冬氨酸酶(AspA)和芽孢桿菌YM55-1天冬氨酸酶(AspB)[7-10]。AspA是已知最具特異性的酶之一,但AspA對其天然底物的高選擇性限制了該酶的實際應用。與AspA相比,AspB具有較高的活性和對映體選擇性、廣泛的親核試劑特異性、相對熱穩(wěn)定性以及缺乏底物或金屬離子的變構調(diào)節(jié),從而在有機合成領域引起了研究者極大的興趣[11]。
已有研究報道天冬氨酸酶基因T187、K324和N326為底物C1羧基的結合殘基,本研究通過克隆構建、定點突變獲得了重組天冬氨酸酶(AspBm)[12],利用酶催化將底物巴豆酸轉化為(R)-3-氨基丁酸(圖1)。與傳統(tǒng)化學方法合成相比,酶法制備更加安全、環(huán)保,制成固定化細胞用于工業(yè)化生產(chǎn)使得生產(chǎn)成本大大降低[13]。
圖1 天冬氨酸酶催化合成(R)-3-氨基丁酸
細菌基因組DNA制備試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔試劑盒,Axygen公司;限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、DpnⅠ,TaKaRa公司;引物合成和基因測序,杭州擎科梓熙生物技術有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物,Oxoid公司,硅藻土、戊二醛、聚乙烯亞胺、氨水、(NH4)2SO4等均為市售生化試劑。
Bacillussp.YM55-1、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET-28a(+)均保藏于本公司。
LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10。
TB培養(yǎng)基(g/L):酵母膏24、胰蛋白胨12、甘油5、KH2PO42.31、K2HPO4·3H2O 16.43。
1.2.1 天冬氨酸酶的克隆
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Bacillussp.YM55-1基因序列設計引物,正向引物F:5′-CGCGGATCCATGAATACCGATGTTCGT-3′,反向引物R:5′-CCGCTCGAGTATTTTCTTCCAGCAATTCCCGG-3′(下劃線部分分別為BamH Ⅰ和XhoⅠ的限制性酶切位點)。挑取Bacillussp.YM55-1單菌落于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)14 h,5 000 r/min離心10 min收集菌體,使用細菌基因組提取試劑盒提取Bacillussp.YM55-1基因組。以獲得的基因組為模板進行PCR,擴增得到天冬氨酸酶基因AspB。擴增程序如下:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒純化,與載體pET-28a(+)分別用BamHⅠ和XhoⅠ于37 ℃雙酶切2 h。酶切反應液使用DNA清潔試劑盒純化后,取適量載體和基因片段,加入DNA連接酶混勻,于16 ℃連接反應12 h。隨后加入到E.coliDH5α感受態(tài)細胞進行轉化,利用卡那霉素抗性篩選得到克隆菌株,測序驗證得到重組質(zhì)粒pET-28a(+)-AspB。
設計天冬氨酸酶基因T187C、K324M和N326C定點突變所需引物,進行定點突變PCR。PCR擴增產(chǎn)物純化后使用DpnⅠ于37 ℃酶切3 h,隨后加入到E.coliDH5ɑ感受態(tài)細胞中進行轉化,轉化液涂布在含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中。挑取單菌落至4 mL LB培養(yǎng)基,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜,抽提質(zhì)粒并送公司測序,確保突變基因正確。將得到的重組突變質(zhì)粒轉入E.coliBL21(DE3),得到重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm。
1.2.2 天冬氨酸酶酶液制備
挑取重組表達菌株單菌落接種到含卡那霉素的4 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)14 h,按體積分數(shù)1%接種量接種至200 mL TB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng),待OD600至0.6~0.8時加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,25 ℃誘導培養(yǎng)16 h。菌液于5 000 r/min離心10 min,收集菌泥,用50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH 7.0)重懸2次后,加入50 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽,超聲波破碎(200~400 W,超聲3 s,間歇5 s,總共8 min),在4 ℃條件下,8 000 r/min離心30 min收集上清液。
1.2.3 天冬氨酸酶活力測定
天冬氨酸酶酶活力的測定參照文獻[9]進行。1 mL反應體系含50 mmol/L pH 7.0 HEPES緩沖液、0.1 mol/L L-天冬氨酸、100 μL適當稀釋濃度的酶液。反應體系于30 ℃反應5 min,立即在240 nm處測定富馬酸吸光值的變化。
酶活定義:在30 ℃、pH 7.0條件下每分鐘生成1 μmol/L富馬酸所需的酶量定義為1個酶活單位,1 U。
1.2.4 SDS-PAGE和蛋白含量測定
SDS-PAGE采用12%分離膠進行電泳。蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法進行。
1.2.5 固定化細胞的制備
將180 mL水加入20 g菌體,充分攪拌,再向菌懸液中加入1.2 g硅藻土和6 mL 5%聚乙烯亞胺,氨水調(diào)控pH至9.0,28 ℃充分攪拌1 h。隨后向溶液中加入2 mL 25%戊二醛進行交聯(lián),維持pH在9.0左右,充分攪拌1 h后進行抽濾,水淋洗2次,4 ℃儲存?zhèn)溆?。固定化細胞前進行了預實驗,設置不同量的硅藻土、聚乙烯亞胺和戊二醛,在上述參數(shù)下,天冬氨酸酶固定化細胞酶活最高。
1.2.6 天冬氨酸酶催化體系
催化體系為(g/L)巴豆酸185、MgSO42.4、(NH4)2SO458.8;氨水調(diào)pH至8.2。固定化天冬氨酸酶菌體量30 g/L,反應溫度為40 ℃,反應開始后氨水調(diào)控pH在8.9~9.1。
重組表達菌株進行誘導表達,超聲波破碎后進行SDS-PAGE,結果見圖2。由圖2可知,天冬氨酸酶大部分存在于上清液中,在分子量為(4.43~6.64)×104位置有明顯的表達條帶,與pET-28a(+)-AspBm理論5.16×104大小相近。
1—E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm IPTG誘導前樣;2—E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm破碎上清液;M—標準蛋白
2.2.1 緩沖液pH對催化反應的影響
圖3 緩沖液pH對反應的影響
2.2.2 溫度對催化反應的影響
保持其他反應條件相同,設置不同反應溫度,考察溫度對反應的影響,結果見圖4。由圖4可知,隨著溫度的升高,酶活得到逐步提高,在40 ℃達到最大。當溫度提高到45 ℃時,相對酶活僅有85.7%,考慮可能是溫度過高導致天冬氨酸酶的穩(wěn)定性變差,從而使酶活變低。因此選擇40 ℃作為最佳反應溫度。
圖4 溫度對反應的影響
2.2.3 菌體量對催化反應的影響
保持其他反應條件相同,設置不同反應菌體量,考察菌體量對反應的影響,結果見圖5。由圖5可見,(R)-3-氨基丁酸的質(zhì)量濃度隨著菌體量的增加而逐漸得到提高,在菌體量為30 g/L時,底物轉化接近99%,進一步增加菌體量會對后續(xù)的產(chǎn)物分離造成一定的困難,同時也存在一定程度的浪費,因此最佳菌體量選擇為30 g/L。
圖5 菌體量對反應的影響
2.2.4 反應時間對催化反應的影響
其他反應條件不變,考察反應時間對反應的影響,結果如圖6所示。由圖6可知,隨著反應時間的延長,產(chǎn)物質(zhì)量濃度得到不斷地提高。在反應前16 h反應速率較快,在22 h后產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增長變得更加緩慢,一方面可能是反應時間過長,酶活力降低,另一方面可能是反應達到平衡。結合實際生產(chǎn),反應時間選擇在22 h。
圖6 反應時間對反應的影響
2.2.5 固定化AspBm催化巴豆酸產(chǎn)(R)-3-氨基丁酸
巴豆酸經(jīng)固定化AspBm催化反應22 h后,產(chǎn)物(R)-3-氨基丁酸收率為97.8%。利用HPLC分析反應18 h和26 h的情況,結果如圖7所示。由圖7可知,反應26 h轉化液幾乎已無巴豆酸殘留,反應較為徹底。
圖7 固定化細胞催化巴豆酸反應18和26 h的HPLC圖譜
2.2.6 重復使用次數(shù)
在上述最優(yōu)條件下進行固定化細胞酶促反應,每批次反應結束后檢測(R)-3-氨基丁酸的質(zhì)量濃度,固定化細胞經(jīng)清洗后立即進入下批次的轉化反應。固定化細胞重復使用次數(shù)的結果如圖8所示。由圖8可知,固定化細胞可重復使用次數(shù)不低于24次,此時(R)-3-氨基丁酸的產(chǎn)率達到89.2%。隨著反應批次的繼續(xù)增多,產(chǎn)率逐漸減小。
圖8 固定化細胞重復使用次數(shù)對反應的影響
從Bacillussp.YM55-1中克隆得到天冬氨酸酶基因,對其序列進行分析,作定點突變,并利用大腸桿菌作為表達宿主,實現(xiàn)了Bacillussp.YM55-1 Asp基因的異源表達。將天冬氨酸酶基因工程菌制備成固定化細胞,考察不同反應條件對天冬氨酸酶催化生成(R)-3-氨基丁酸產(chǎn)量的影響,結果發(fā)現(xiàn):反應緩沖液pH控制在9.0、反應溫度40 ℃、反應時間22 h、菌體量為30 g/L時,產(chǎn)物的質(zhì)量濃度能達到220 g/L,轉化率達到98%以上?;蚬こ叹潭ɑ毎噙_24次的重復使用,使得工業(yè)化生產(chǎn)(R)-3-氨基丁酸的成本得到顯著降低。在本項目研究過程中,發(fā)現(xiàn)隨著底物巴豆酸質(zhì)量濃度的提高,天冬氨酸酶耐受性變差,反應轉化率隨之降低。倘若通過諸如一些分子生物學方面的技術來改造天冬氨酸酶,或許可以提高酶的穩(wěn)定性和酶活力,從而使工業(yè)化生產(chǎn)成本得到進一步的降低,同時對于降低度魯特韋的售價也能起到一定的作用。