布比卡因介導神經(jīng)細胞DNA損傷后修復通路的激活*

駱佳銘， 李 機， 徐世元， 趙 偉

（南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510282）

局麻藥（local anesthetics）是臨床局部麻醉和疼痛治療的常用藥物，但其高濃度或長期作用于神經(jīng)周圍時，會誘發(fā)神經(jīng)細胞的毒性損傷反應［1］。神經(jīng)細胞損傷后的修復機制多種多樣，其中神經(jīng)細胞DNA損傷的修復直接關系到神經(jīng)細胞的結(jié)構和功能的恢復而備受關注，目前局麻藥導致的神經(jīng)細胞毒性損傷后DNA損傷的修復機制尚未明確［2］。

有證據(jù)表明，氧化應激是導致細胞DNA損傷的重要因素之一［3］。DNA損傷的類型多種多樣，損傷后的DNA會啟動相關的損傷修復信號通路［4］。而氧化應激導致的細胞DNA的損傷主要是以氧化型堿基損傷居多，該類DNA氧化損傷主要是通過切除修復機制完成修復，如DNA堿基切除修復（base excision repair，BER）和核酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）［5］。局麻藥布比卡因（bupivacaine）也可通過細胞內(nèi)氧化應激爆發(fā)造成神經(jīng)細胞的DNA損傷誘發(fā)神經(jīng)細胞凋亡甚至壞死，由此引起神經(jīng)功能并發(fā)癥［6-7］。布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細胞DNA損傷后哪些修復通路參與國內(nèi)外尚未見報道。

本研究首先建立布比卡因?qū)е碌腟H-SY5Y神經(jīng)細胞DNA損傷模型，再應用cDNA微孔板陣列技術進行DNA損傷修復通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復酶的基因篩查。通過cDNA微孔板對21個DNA損傷修復相關的基因進行表達譜的篩查，再通過信息分析得到相關的DNA損傷修復通路的激活情況。明確布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細胞DNA損傷后哪些修復通路參與，可為臨床上防治該類局麻藥的神經(jīng)毒性損傷選擇新的靶點治療藥物提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

實驗用SH-SY5Y細胞系購買于中科院上海細胞庫。鹽酸布比卡因（純度＞99%）購買于Sigma-Aldrich；彗星實驗試劑盒CometAssay?購買于美國GENMED；CCK-8試劑盒購買于日本同仁公司；Western blot實驗用抗β-tubulin和p-γH2AX抗體購買于CST；抗兔/鼠 II抗購買于Bioworld Technology；cDNA微孔板陣列實驗試劑盒購買于Signosis。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測布比卡因處理SH-SY5Y細胞后活力的變化 將SH-SY5Y細胞消化成細胞懸液后并計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×108/L，接種細胞于96孔板中（即每孔細胞約為1×104個）。細胞貼壁24 h后，用含0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L布比卡因的培養(yǎng)基處理細胞3 h后，換成正常培養(yǎng)基孵育24 h。向各孔中加入10μL的CCK-8溶液，再37℃孵育4 h后，酶標儀讀板，測定450 nm處的A值。細胞活力（%）=［加藥-空白組A值］/［0加藥-空白］×100%。

2.2 彗星實驗檢測布比卡因處理SH-SY5Y細胞后DNA的損傷情況 布比卡因的IC50值濃度處理SHSY5Y細胞3 h后，換成正常培養(yǎng)基再孵育24 h作為損傷模型組，對照組不用布比卡因處理。將分組處理好的細胞用PBS漂洗1遍，重懸后38°C水浴待用，然后用低熔點瓊脂糖凝膠與預處理的細胞懸液混合后均勻鋪在彗星玻璃板（每孔20μL）；待細胞凝膠完全冷卻后進行裂解、解旋、水平電泳后輕輕漂洗2次再避光靜置10 min后染色，熒光顯微鏡下觀察PI染色的細胞核圖象呈紅色熒光，通過觀察發(fā)現(xiàn)核DNA（彗星頭部）呈紅色圓球形和遷移的DNA（即慧星尾）呈散在的拖尾。每個實驗分組隨機選擇50個彗星圖像觀察并記錄，并用相應的軟件分析分析彗星實驗的相關指標如Olive tail moment。DNA損傷按彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例分為5級：＜5%無損傷者為0級；5%～20%輕度損傷者為1級；20%～40%中度損傷者為2級；40%～95%高度損傷者為3級；＞95%重度損傷者位4級。

2.3 Western blot檢測DNA損傷相關蛋白的表達取各組處理后的6孔板細胞，以預冷的PBS洗滌3次后加入100μL含10%PMSF和5%磷酸酶抑制劑的細胞裂解液（使用前5 min配制）低溫離心取蛋白上清液后，進行蛋白定量。上樣后進行SDS-PAGE，電泳完成后再用200 mA恒定電流進行0.2μm PVDF轉(zhuǎn)膜90 min，封閉1 h，繼續(xù)孵I抗過夜，TBST緩沖液清洗3次后，室溫下孵II抗1 h，再次用TBST清洗3次，化學發(fā)光儀進行檢測。用Image J軟件分析照片中蛋白的A值，以目的蛋白A值/內(nèi)參蛋白β-tubulin A值的比值反映目的蛋白相對表達水平。

2.4 cDNA微孔板陣列技術篩查DNA損傷修復相關基因 首先建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細胞SHSY5Y毒性損傷模型，再應用cDNA微孔板陣列技術做關于DNA損傷修復通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復酶的基因篩查如：DNA損傷修復從損傷的應答（DNA damage respond，DDR），損傷部位的識別（DNA recognition），再到修復（DNA repair）的過程，每一個步驟都有其起關鍵調(diào)控作用的基因。檢測的基因 目 錄 包 括 ：（1）DDR：ATM、ATR、DNA-PKcs、Rad50（MRN complex）、BRCA1、CHK2、p21、P53和PTEN（phosphatase and tensin homolog）、GADD45、RAD9、NBS1；（2） DNA recognition：DDB、XPCHR23B；（3）DNA repair：OGG1、NTH1、CSB、XPA、XPD、TFIIH和MLH1。

采用Signosis的專利產(chǎn)品cDNA微孔板陣列［8］，它是基于微孔板雜交原理的一種檢測方法，其是通過將生物體內(nèi)的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后來達到檢測多種基因表達的目的，可高度敏感度地定量甚至定性檢測目的基因的表達水平，同時還可以比較不同樣本之間的特定基因表達水平的差異［8］。

cDNA微孔板為96孔，每組Sample安排3列，按照陣列實驗的設計Sample 1和Sample 2是對照C（control）組，Sample 3和Sample 4為布比卡因處理組（模型組）。

6孔板培養(yǎng)的正常組和布比卡因處理組細胞用Trizol reagent（GIBCO BRL）抽 提 細 胞 總 RNA，用QuickPrep Micro mRNA純化試劑盒分離純化總RNA中的mRNA。本實驗采用Signosis公司。探針的制備和雜交按照試劑盒用戶手冊中提供的方法和試劑操作?？俁NA先轉(zhuǎn)錄成生物素標記的cDNA。通過預包被在微孔板上的特異的寡核酸，將靶基因捕獲到微孔板上（而不是膜上）。捕獲的cDNA進一步通過鏈酶親和素辣根酶（HRP）檢測。加入HRP發(fā)光底物，cDNA的濃度與待測標本的發(fā)光強度成正比。檢測板置于化學發(fā)光檢測儀上進行相對光單位（RLU）測定。

兩次實驗結(jié)果的均值進行以下數(shù)據(jù)處理，并做柱狀圖：（1）Blank對數(shù)據(jù)進行normalization（每個指標的RLU減去blank均值）；（2）β-actin對數(shù)據(jù)進行normalization，步驟（1）處理后的數(shù)據(jù)中，每個樣本除β-actin和blank之外的指標與β-actin其RLU數(shù)值做比值；（3）需要兩兩比較的樣本，對應指標做比值，并以底數(shù)2求對數(shù)，即可得到relative mRNA expression（log2 ratio），并做柱狀圖。以上數(shù)據(jù)處理及繪圖均在Excel軟件中進行。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。所有實驗均獨立重復至少3次（n≥3），實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組之間的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 不同濃度梯度的布比卡因處理SH-SY5Y細胞后細胞活力的變化

分別用含0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L布比卡因的培養(yǎng)基處理細胞3 h后，換成正常培養(yǎng)基孵育24 h，采用CCK-8法檢測各組細胞活力。結(jié)果顯示：通過CCK-8檢測不同濃度布比卡因處理細胞后，布比卡因的IC50值為1.5 mmol/L，見圖1。

Figure 1.The effect of different concentrations of bupivacaine on SH-SY5Y cell viability.Mean±SD.n=5.圖1 不同濃度布比卡因?qū)H-SY5Y細胞生長活力抑制作用

2 布比卡因致SH-SY5Y細胞DNA損傷加重

彗星實驗（comet assay）是一種比較理想的單細胞水平檢測哺乳類有核細胞DNA損傷的技術［9］。結(jié)果顯示，與對照組比較，布比卡因處理SH-SY5Y細胞組的DNA損傷明顯加重，彗星實驗相關損傷指標彗星尾部DNA比例（Tail DNA%）和尾距（Olive tail moment）明顯增高，而彗星頭部DNA比例明顯降低（P＜0.01），見圖2。γH2AX蛋白的磷酸化水平是DNA損傷的一個新的特異性指標［10］，與對照組比較，布比卡因處理SH-SY5Y細胞組的γH2AX磷酸化水平明顯增高（P＜0.05），見圖3。

3 cDNA微孔板陣列技術檢測結(jié)果

首先建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細胞SH-SY5Y毒性損傷模型，再應用cDNA微孔板陣列技術做關于DNA損傷修復通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復酶的基因篩查，見圖4、5。

4 布比卡因造成的神經(jīng)細胞DNA損傷的修復途徑分析

Figure 2.DNA damage after treatment of SH-SY5Y cells with bupivacaine at IC50value of 1.5 mmol/L.Compared withcontrol group，the proportion of DNA in the tail of the comet assay inbupivacaine group（Tail DNA%）and the tail tail（Olive tail moment）were significantly increased，while the proportion of DNA in the head of the comet was significantly reduced.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖2 布比卡因IC50值1.5 mmol/L濃度處理SH-SY5Y細胞后DNA損傷情況

如表1所示，通過cDNA微孔板對21個DNA損傷修復相關的基因進行表達譜的篩查，我們發(fā)現(xiàn)局麻藥導致的神經(jīng)細胞DNA損傷后差異表達的修復基因主要集中在以下3修復通路：（1）堿基切除修復（base excision repair）；（2）核酸切除修復（nucleotide excision repair）；（3）.非同源重組修復（Non-homologous end-joining）。以上信號通路信息分析來自于KEEG Pathway Database數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）。

討 論

局麻藥是臨床上局部麻醉和疼痛治療的常用藥物之一，但該類藥物突然高濃度或長期作用于神經(jīng)周圍時，可能會誘發(fā)神經(jīng)細胞的毒性損傷反應。局麻藥的種類、劑量和時間等可影響局麻藥的神經(jīng)毒性，作用機制可能與局麻藥影響細胞膜鈣離子通道、細胞內(nèi)鈣離子濃度及誘導細胞凋亡與炎性反應等相關［11-12］。神經(jīng)細胞損傷后的修復機制多種多樣，其中神經(jīng)細胞DNA損傷的修復直接關系到神經(jīng)細胞的結(jié)構和功能的恢復而備受關注。

Figure 3.Western blot analysis of DNA damage-related protein expression after treatment of SH-SY5Y cells with bupivacaine at 1.5 mmol/L.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖3 Western blot檢測1.5 mmol/L布比卡因處理SH-SY5Y細胞后DNA損傷相關蛋白的表達

生物體DNA頻繁接受體內(nèi)與外環(huán)境中有害因素的威脅，但機體存在一套完整的DNA損傷后應答機制［13］。當機體DNA損傷發(fā)生損傷后會激活細胞周期“防火墻”（cell cycle checkpoint），該“防火墻”就像汽車的剎車系統(tǒng)一樣，可暫時阻滯細胞周期的進展，而且還會激活相關的修復通路對損傷的DNA進行修復［14］，但如果DNA損傷無法完全被修復的話，則會引起細胞凋亡甚至死亡［15］。

由于危險因素的種類和作用機制不同，DNA損傷的類型也是多種多樣，損傷后的DNA會啟動相關的損傷修復信號通路［4］。氧化應激/ROS導致的細胞DNA的損傷主要是以氧化型堿基損傷居多，應對這類氧化損傷主要是通過切除修復機制完成修復，如：DNA堿基切除修復和核酸切除修復［16］。局麻藥導致的神經(jīng)細胞DNA損傷后與上述修復通路關系如何及其修復能力的強弱國內(nèi)外尚未見報道。

有證據(jù)表明，氧化應激/ROS是導致細胞DNA損傷的重要因素之一［17］。前期我們的研究也已證實了細胞內(nèi)氧化應激/ROS爆發(fā)是局麻藥導致神經(jīng)細胞毒性損傷的重要機制之一［6-7］。因此，局麻藥也可能通過細胞內(nèi)氧化應激爆發(fā)造成神經(jīng)細胞的DNA損傷，由此引起神經(jīng)功能并發(fā)癥！DNA損傷類型多種多樣，損傷后的DNA會啟動相應的修復機制［4］。

Figure 4.The results of 21 DNA damage repair related genesanalyzed by cDNA microplate array.The value was above 0 represented up-regulated genes，while that was below 0 represented down-regulated genes after bupivacaine treatment.圖4 應用cDNA微孔板陣列技術分析了21個DNA損傷修復相關基因

Figure 5.The results of cDNA microplate arrays，in which differentially up-regulated DNA damage repair related genes were showed.圖5 cDNA微孔板陣列的結(jié)果

DNA損傷修復從損傷的應答（DNA damage response）、損傷部位的識別（DNA recognition），再到修復（DNA repair）的過程，每一個步驟都有其起關鍵調(diào)控作用的基因［18］。因此，針對布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細胞DNA損傷的修復，可能有幾十甚至上百種修復酶參與該過程，這是一個龐大而且復雜的修復機制網(wǎng)絡。cDNA微陣列技術可高敏感度檢測不同處理組之間基因表達水平的差異［19］。本研究首先建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細胞SH-SY5Y毒性損傷模型，再應用cDNA微孔板陣列技術做關于DNA損傷修復通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復酶的基因篩查。通過cDNA微孔板對21個DNA損傷修復相關的基因進行表達譜的篩查，我們發(fā)現(xiàn)局麻藥導致的神經(jīng)細胞DNA損傷后差異表達的修復基因主要集中在以下3條修復機制：（1）非同源末端修復；（2）堿基切除修復；（3）核酸切除修復。然而，由于現(xiàn)有cDNA微孔板產(chǎn)品技術的限制，我們暫不能把所有DNA損傷修復相關的基因全部篩查，而只能根據(jù)相關文獻報道的DNA損傷修復過程中可能涉及到的關鍵修復基因作為本研究的篩選對象。這也正是本研究的局限性和不足之處。

本研究中我們探討了局麻藥布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細胞DNA損傷修復基因水平的激活情況，可為臨床上防治該類局麻藥的神經(jīng)毒性損傷選擇新的靶點治療藥物提供理論依據(jù)。但眾所周知，蛋白質(zhì)才是細胞內(nèi)生物學功能主要執(zhí)行者。局麻藥布比卡因?qū)е律窠?jīng)細胞DNA損傷后哪些修復蛋白和修復通路會被激活？這些修復蛋白的激活與基因水平激活情況又是否存在差異？值得我們進一步研究。

表1 顯示差異表達的修復基因通過數(shù)據(jù)庫比對后所富集的修復通路Table 1.The repair pathways of differentially expressed repair genes enriched by database alignment