青藤堿通過miR-23b-3p/FGF9誘導(dǎo)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡*

李 嘉， 付婷婷， 張光峰， 劉向前， 陳 民△

（廣東省人民醫(yī)院 1正骨科，2中醫(yī)科，3風(fēng)濕科，廣東廣州510080）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫病，以滑膜異常增生、滑膜炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕卣?，成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（fibroblastlike synoviocytes，F(xiàn)LS）的過度增殖和凋亡不足是導(dǎo)致滑膜炎和骨破壞的重要原因［1］。因此，抑制滑膜細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡是治療RA的重要途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)中藥及其有效成分可影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖和凋亡，可為治療RA提供新途徑［2］。

青藤堿（sinomenine，SIN）是從傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤中提取的堿類單體，具有免疫抑制和抗炎作用，治療RA效果較好［3］。SIN可通過降低關(guān)節(jié)滑漠中炎癥因子的表達(dá)改善RA發(fā)病進(jìn)展和患者生存質(zhì)量［4］。SIN可防止軟骨和軟骨下骨破壞造成的關(guān)節(jié)畸形［5］。SIN還能抑制滑膜細(xì)胞異常增殖，誘導(dǎo)其凋亡［6］。然而SIN對(duì)RA FLS增殖和凋亡的分子機(jī)制尚不清楚。

微小RNA-23b-3p（microRNA-23b-3p，miR-23b-3p）通過靶向X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）可抑制RA FLS增殖，促進(jìn)其凋亡［7］。miR-23b可抑制與白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）相關(guān)的自身免疫炎癥［8］。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9（fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員之一，可促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化，影響骨質(zhì)疏松［9］。FGF9是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3）的特異性配體，可激活激活FGFR3；而FGFR3信號(hào)的激活可減緩骨性關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨損傷的進(jìn)程［10］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究SIN對(duì)RA FLS增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制是否與miR-23b-3p和FGF9有關(guān)。

材料和方法

1 滑膜標(biāo)本采集

本實(shí)驗(yàn)用滑膜標(biāo)本取自本院2017年1月～2019年1月行關(guān)節(jié)鏡滑膜切除的RA患者關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織，患者診斷癥狀符合美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)1987年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；所取關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織的患者均同意取其滑膜組織，且同意用于本研究，并簽署了知情同意書。

2 主要試劑與藥品

SIN（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購(gòu)自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；CCK-8、凋亡檢測(cè)試劑盒和雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；抗FGF9、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及β-actin單抗購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司；羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；Trizol試劑和熒光定量試劑盒購(gòu)自上海百研生物科技有限公司。

3 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Precision Scientific）；LightCycler 480熒光定量PCR儀（Roche）；酶標(biāo)儀（Thermo）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀、PowerPac蛋白電泳儀及Gel Doc XR+凝膠顯示系統(tǒng)（Bio-Rad）。

4 方法

4.1 人RA FLS的分離培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下將類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織除去多余組織，磷酸鹽沖洗后剪碎，用胰酶和膠原酶消化后在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，將RA FLS接種在6孔細(xì)胞板，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)用4%多聚甲醛固定，再用0.5%Triton X-100室溫通透20 min，封閉液封閉1 h，加入I抗4℃孵育過夜，加入II抗孵育1 h。DAPI染色后封片，干燥后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞核卵圓居中，符合FLS形態(tài)。取4～6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.2 細(xì)胞處理與分組 用100 mg/L的LPS處理RA FLS記為L(zhǎng)PS組；3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同處理細(xì)胞，記為L(zhǎng)PS+SIN組；不作任何處理的細(xì)胞作為空白（blank）組。將miR-con、miR-23b-3p、si-con和si-FGF9轉(zhuǎn)染至RA FLS中再用100 mg/L LPS處理，分別記為L(zhǎng)PS+miR-con組、LPS+miR-23b-3p組、LPS+si-con組和LPS+si-FGF9組；將anti-miR-con、anti-miR-23b-3p、pcDNA和 pcDNA-FGF9轉(zhuǎn)染至 RA FLS中，再用3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同處理，分別記為L(zhǎng)PS+SIN+anti-miR-con組、LPS+SIN+anti-miR-23b-3p組、LPS+SIN+pcDNA組和LPS+SIN+pcDNA-FGF9組。

4.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 選擇各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，每孔中加入10μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（A）值。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.4 集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成1×107/L細(xì)胞懸液，以每孔100個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2周出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞集落時(shí)終止培養(yǎng)，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的集落。

4.5 Western blot法檢測(cè) FGF9、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再分別加入I抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；加入II抗（1∶2 000）室溫孵育90 min，ECL發(fā)光液顯影，ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One凝膠分析軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500μL的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10μL的annexin V-FITC，再加入5μL的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.7 RT-qPCR檢測(cè)miR-23b-3p和FGF9 mRNA的表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-23b-3p和FGF9分別以U6和GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。循環(huán)條件為95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。miR-23b-3p的上游引物序列為5'-CACAAAGGCATCTCTACGCCCATC-3'，下游引物序列為5'-TGTAGCTGCC TCGCCAGAGGC-3'；U6的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；FGF9的上游引物序列為5'-AAGGACTGCGGCCTGATG-3'，下游引物序列為5'-TTTGCTTTAAGTTCA CTGCGATG-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3'，下游引物序列為5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3'。目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCt法計(jì)算。

4.8 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-23b-3p和FGF9的靶向關(guān)系 構(gòu)建包含miR-23b-3p結(jié)合位點(diǎn)的FGF9 3'UTR野生型和突變型螢光素酶載體（WTFGF9和 MUT-FGF9），將其與 miR-con、miR-23b-3p、anti-miR-con或anti-miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染至RA FLS中，轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)螢光素酶相對(duì)活性。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SIN抑制LPS誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖

與空白組相比，LPS組的細(xì)胞活力升高，細(xì)胞集落形成數(shù)增多（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+SIN組細(xì)胞活力降低，細(xì)胞集落形成數(shù)減少（P＜0.05），見表1。

表1 青藤堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞活力和集落形成的影響Table 1.The effects of sinomenine（SIN）on the viability and colony formation of human rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocytes induced by LPS（Mean±SD.n=9）

2 SIN促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡

與空白組相比，LPS組cleaved caspase-3和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+SIN組cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖1。

3 SIN對(duì)LPS誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞miR-23b-3p和FGF9表達(dá)的影響

與空白組相比，LPS組miR-23b-3p的表達(dá)水平降低，F(xiàn)GF9的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+SIN組的miR-23b-3p表達(dá)水平升高，F(xiàn)GF9的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖2。

Figure 1 The effects of sinomenine（SIN）on human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte apoptosis and expression of cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 proteins induced by LPS.A：Western blot was used to determine the protein levels of cleaved caspase-3，Bax，and Bcl-2 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs blank group；#P＜0.05 vs LPS group.圖1 青藤堿對(duì)LPS誘導(dǎo)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡和cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Figure 2.The effects of sinomenine（SIN）on the expression of miR-23b-3p，F(xiàn)GF9 mRNA and FGF9 protein in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes induced by LPS.A，B：RT-qPCR was used to determine the expression of miR-23b-3p and FGF9 mRNA in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；C：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs blank group；#P＜0.05 vs LPS group.圖2 青藤堿對(duì)LPS誘導(dǎo)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞miR-23b-3p、FGF9 mRNA及FGF9蛋白表達(dá)的影響

4 miR-23b-3p靶向調(diào)控FGF9的表達(dá)

TargetScan預(yù)測(cè)顯示miR-23b-3p與FGF9存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，與miR-con組相比，miR-23b-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-FGF9載體的細(xì)胞螢光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與antimiR-con組相比，anti-miR-23b-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-FGF9載體的細(xì)胞螢光素酶活性顯著升高（P＜0.05）；各組轉(zhuǎn)染MUT-FGF9載體的細(xì)胞螢光素酶活性無顯著差異，見圖3B。與miR-con組相比，miR-23b-3p組FGF9表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-con組相比，anti-miR-23b-3p組FGF9表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖3C。

5 轉(zhuǎn)染miR-23b-3p或沉默F(xiàn)GF9抑制LPS誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡

Figure 3.Targeted binding site of miR-23b-3p to FGF9 3'UTR（A），dual-luciferase reporter assay results（B）and Western blot to determine the protein expression of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes（C）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-con group；#P＜0.05 vs anti-miR-con group.圖3 miR-23b-3p與FGF9 3'UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)、雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果和Western blot檢測(cè)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞FGF9蛋白的表達(dá)

與LPS+miR-con組相比，LPS+miR-23b-3p組miR-23b-3p表達(dá)水平升高，F(xiàn)GF9表達(dá)水平降低，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞集落形成數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與LPS+si-con組相比，LPS+si-FGF9組FGF9表達(dá)水平降低，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞集落形成數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖4。

6 干擾miR-23b-3p或過表達(dá)FGF9抑制LPS誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡

與LPS+SIN+anti-miR-con組相比，LPS+SIN+anti-miR-23b-3p組的miR-23b-3p表達(dá)水平降低，F(xiàn)GF9的表達(dá)水平升高，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞集落形成數(shù)升高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與LPS+SIN+pcDNA組相比，LPS+SIN+pcDNA-FGF9組FGF9的表達(dá)水平升高，cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞集落形成數(shù)升高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖5。

討 論

RA是一種常見的風(fēng)濕性疾病，其致殘率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，中醫(yī)藥治療RA療效好，安全性高，具有一定優(yōu)勢(shì)［11］。RAFLS是滑膜細(xì)胞的主要組成成分，在RA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［12］。已有研究表明SIN可降低RA患者體內(nèi)炎癥因子，改善患者臨床癥狀，具有治療RA的作用［13］。SIN聯(lián)合甲氨蝶呤對(duì)RA FLS具有協(xié)同抑制作用，抑制RA骨破壞［14］。本實(shí)驗(yàn)通過用LPS處理RA FLS模擬其在體內(nèi)環(huán)境，用SIN作用LPS處理的RA FLS，結(jié)果顯示，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞集落形成數(shù)減少，cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平升高，Bcl-2的蛋白水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，表明SIN可抑制RA FLS增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

miRNA是一類保守的非編碼單鏈小分子RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)導(dǎo)致蛋白翻譯抑制或促進(jìn)靶mRNA降解，miRNA與關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞異常增殖的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)［15］。研究報(bào)道m(xù)iR-23b-3p可抑制RAFLS增殖，促進(jìn)其凋亡［7］。研究還發(fā)現(xiàn)抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）/疾病修飾抗風(fēng)濕藥聯(lián)合治療RA患者血清中的miR-23-3p上調(diào)表達(dá)，其作為抗TNF-α治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者治療效果的潛在生物標(biāo)志物［16］。miR-23b-3p下調(diào)通過增加Bax和caspase-3的表達(dá)顯著抑制白細(xì)胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)的CHON-001細(xì)胞凋亡［17］。miR-23b-3p在心房成纖維細(xì)胞通過靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β III型受體（transforming growth factor-beta III receptor，TGFBR3）增強(qiáng)與纖維化相關(guān)基因的表達(dá)［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-23b-3p后，cleaved caspase-3和Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，細(xì)胞活力降低，細(xì)胞集落形成數(shù)降低，細(xì)胞凋亡率升高，說明過表達(dá)miR-23b-3p可抑制RAFLS增殖，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)SIN處理的RA FLS中miR-23b-3p表達(dá)水平升高，說明SIN可上調(diào)miR-23b-3p表達(dá)。且干擾miR-23b-3p逆轉(zhuǎn)了SIN對(duì)LPS誘導(dǎo)的RA FLS增殖和凋亡的影響，提示，SIN可能通過上調(diào)miR-23b-3p影響RA FLS增殖和凋亡。

Figure 4.The effects of transfection with miR-23b-3p or silencing of FGF9 on LPS-induced human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cell proliferation，apoptosis，and cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 protein levels.A：RT-qPCR was used to determine the expression level of miR-23b-3p in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：MTT detection of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte viability；C：colony formation test to detect the number of colonies；D：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；E，F(xiàn)：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs LPS+miR-con group；#P＜0.05 vs LPS+si-con group.圖4 轉(zhuǎn)染miR-23b-3p或沉默F(xiàn)GF9對(duì)LPS誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖、凋亡及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

研究報(bào)道FGF9在RA組織中高表達(dá)，參與RA關(guān)節(jié)破壞的發(fā)?。?9］。miR-4317通過靶向FGF9抑制非小細(xì)胞肺癌增殖和集落形成［20］。miR-372-3p通過靶向FGF9促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌中的細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)GF9抑制LPS誘導(dǎo)的RA FLS增殖并增加細(xì)胞凋亡。SIN處理的RAFLS中FGF9下調(diào)表達(dá)，且過表達(dá)FGF9逆轉(zhuǎn)了SIN對(duì)LPS誘導(dǎo)的RA FLS增殖和凋亡的影響，說明SIN影響RA FLS增殖和凋亡可能與FGF9表達(dá)有關(guān)。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p靶向負(fù)調(diào)控FGF9，提示SIN可能通過調(diào)控miR-23b-3p影響FGF9的表達(dá)進(jìn)而影響RA FLS的增殖和凋亡。

綜上所述，SIN可通過miR-23b-3p/FGF9信號(hào)通路促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的RA FLS凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

Figure 5.The effects of transfection of miR-23b-3p or overexpression of FGF9 on LPS-induced human rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocyte proliferation，apoptosis，and cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 protein levels.A：RT-qPCR was used to determine the expression level of miR-23b-3p in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：MTT detection of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte viability；C：colony formation test to detect the number of colonies；D：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；E，F(xiàn)：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs LPS+SIN+anti-miR-con group；#P＜0.05 vs LPS+SIN+pcDNA group.圖5 轉(zhuǎn)染miR-23b-3p或過表達(dá)FGF9對(duì)LPS誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖、凋亡及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響