亞麻木酚素通過抑制TXNIP和激活NLRP3炎癥小體減輕慢性間歇性低氧小鼠腎臟炎癥損傷*

劉 寒， 郭亞凈， 趙亞碩， 任 靜， 周 健， 吉恩生

（河北中醫(yī)學(xué)院科研中心，河北石家莊050200）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，以慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）為主要特征，患病率較高，在肥胖人群中高達(dá)70%，且臨床數(shù)據(jù)顯示不同年齡階段男性的患病率均高于女性［1］。其主要表現(xiàn)為睡眠期間反復(fù)發(fā)生上呼吸道的部分或完全阻塞，導(dǎo)致睡眠片段化、低氧血癥和高碳酸血癥［2］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，過去20年間未經(jīng)治療的OSA患者患晚期腎臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加［2-3］。更有臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，患有慢性腎病的患者多伴發(fā)失眠和呼吸障礙性疾病［4］。并且有學(xué)者提出長(zhǎng)期的CIH會(huì)造成機(jī)體氧化應(yīng)激、慢性炎癥和代謝紊亂。

硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）［5］是機(jī)體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要成員，在各種病原刺激下（如LPS、病毒、氧化應(yīng)激等）與硫氧還蛋白1（thioredoxin-1，TRX-1）解離，并與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）結(jié)合從而激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)炎癥因子白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的釋放，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。

近年來，亞麻籽因含有的某些生物活性成分如可溶性膳食纖維、木酚素和α-亞麻酸所帶來的健康效益而受到廣泛的關(guān)注。亞麻籽中含量最高且最主要的是亞麻木酚素（flax lignan）［6］，又稱為開環(huán)異落葉松脂素二葡萄糖苷（secoisolariciresinol diglucoside，SDG），是良好的天然抗氧化劑，具有多方面的藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松和糖尿病等。本研究以SDG的抗氧化、抗炎作用為出發(fā)點(diǎn)探討其是否可以減輕CIH引起的腎臟炎癥損傷及其潛在的機(jī)制研究。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6N小鼠30只，雄性，6～8周齡，18～20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物飼料和墊料購(gòu)自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程股份有限公司。

2 主要儀器與試劑

2.1 主要儀器 動(dòng)物CIH裝置（Oxycycler Model 84）購(gòu)自BioSpherix；多功能成像系統(tǒng)Fusion FX5 Spectra購(gòu)自VIBER LOURMAT；多功能微孔板讀數(shù)儀Varioskan LUX購(gòu)自Thermo Fisher；顯微拍照系統(tǒng)購(gòu)自Leica；全自動(dòng)生化分析儀Chemray 240購(gòu)自深圳雷杜生命科技有限公司。

2.2 主要藥品與試劑 SDG購(gòu)自愛必信生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒（批號(hào)A001-1-2）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒（批號(hào)A003-1-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；抗NLRP3抗體、抗含CARD的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）抗體、抗caspase-1抗體、抗IL-1β和抗IL-18抗體購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；抗TXNIP抗體購(gòu)自Proteintech；RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Tween-20和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型的建立及分組 將C57BL/6N小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為3組：正常（control）組、模型（CIH）組和治療（SDG）組，每組10只。SDG在臨用前用生理鹽水配成混懸液，連續(xù)給藥35 d（30 mg/kg，根據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，通過臨床人用藥量折算小鼠用藥量），另外2組給予等量生理鹽水。分別在小鼠上艙0.5 h前以灌胃方式給予。將模型組和治療組放置于間歇性低氧艙內(nèi)，每天持續(xù)時(shí)間8 h（8：00～16：00），共持續(xù)35 d，低氧艙程序設(shè)計(jì)為每一低氧復(fù)氧循環(huán)時(shí)間為3 min，前1.5 min充入100%N2使氧氣濃度降至9%，后1.5 min充入O2使氧氣濃度恢復(fù)到21%，如此循環(huán)，模擬中重度OSA。

3.2 標(biāo)本的采集 動(dòng)物模型建立完成，各組小鼠禁食不禁水12h后，稱重。用1%的戊巴比妥鈉麻醉，眼球摘除取血，分離血清，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩４蜷_腹腔，迅速摘取腎臟，在冰板上去除腎表面的被膜并稱重。左腎放入4%多聚甲醛溶液中，以備后續(xù)的石蠟切片，剩余組織保存于-80℃冰箱。

3.3 腎功能指標(biāo)的檢測(cè) 應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量。

3.4 組織標(biāo)本的處理和指標(biāo)的檢測(cè) 將在4%多聚甲醛中固定的腎臟組織經(jīng)梯度乙醇脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度為5μm，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察腎小球和腎小管形態(tài)變化；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腎臟組織中NLRP3和TXNIP的蛋白表達(dá)情況，利用Image-Pro Plus 6.0對(duì)圖像進(jìn)行吸光度分析。

3.5 相關(guān)炎癥因子和抗氧化指標(biāo)的檢測(cè) ELISA法測(cè)定小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，具體步驟按試劑盒說明書操作，終止后使用酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上讀出各孔吸光度（A）值，并根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組小鼠血清中炎癥因子的含量。羥胺法和硫代巴比妥酸法檢測(cè)腎組織SOD的活性和MDA的含量，具體步驟根據(jù)南京建成MDA測(cè)試盒和SOD測(cè)試盒說明書進(jìn)行，分析腎臟組織氧化程度。

3.6 Western blot檢測(cè)腎臟組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) 稱取小鼠腎臟組織30 mg左右，每10 mg組織加入已預(yù)冷的RIPA裂解液100μL，置于冰上15 min，隨后用組織破碎儀進(jìn)行破碎，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，最后通過Western blot檢測(cè)腎臟組織中TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey's法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CIH對(duì)小鼠腎臟指數(shù)的影響

與正常組相比，模型組小鼠體重和腎臟指數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與模型組相比，SDG治療組（以下簡(jiǎn)稱治療組）的小鼠體重和腎臟指數(shù)的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），由此說明，CIH對(duì)小鼠體重?zé)o影響，見表1。

2 CIH對(duì)小鼠腎功能的影響

與正常組相比，模型組小鼠SCr水平有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且經(jīng)過治療后，有所好轉(zhuǎn)；BUN水平變化不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠腎重、體重、腎臟指數(shù)、血尿素氮和血清肌酐的比較Table 1.The comparison of renal weight，body weight，ratio of renal weight to body weight（n=6），and blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（SCr）of the mice（n=4）in each group（Mean±SD）

3 SDG減輕CIH小鼠的腎臟病理損傷

3.1 腎臟解剖觀察 將小鼠腹腔打開，仔細(xì)觀察小鼠腎臟大小、形態(tài)、顏色。正常組、模型組和治療組的腎臟大小基本一致，表面光滑、無腫脹、無出血，無明顯差異，模型組腎臟顏色較正常組顏色加深，其他變化不明顯，見圖1。

3.2 腎臟病理學(xué)觀察 HE染色顯示正常組小鼠腎小球、腎小管形狀規(guī)則，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻；模型組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死（箭頭所示），腎小管上皮細(xì)胞中出現(xiàn)大小不等的空泡，少量腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落；治療組腎小球形態(tài)正常，少量腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，見圖2。

Figure 1.The macroscopic changes of renal tissues.圖1 腎臟大體觀察

Figure 2.HE staining for observing the pathological changes of renal tissues.The scale bar=12.5μm.圖2 腎臟組織HE染色觀察

4 SDG減輕CIH小鼠的腎臟炎癥損傷

4.1 ELISA檢測(cè)血清中促炎因子的水平 與正常組相比，模型組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量顯著升高，治療組血清中TNF-α和IL-1β的含量較模型組顯著下降（P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平及腎臟組織SOD活性和MDA含量的測(cè)定Table 2.The serum levels of inflammatory factors，and the activity of SOD and the content of MDA in the renal tissues of each group（Mean±SD.n=4）

4.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腎組織NLRP3蛋白的表達(dá)水平 NLRP3蛋白主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，且積分吸光度（integral absorbance，IA）統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組NLRP3蛋白的表達(dá)量顯著增多（P＜0.05），與模型組相比，治療組NLRP3蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），說明SDG具有良好的治療作用，見圖3。

4.3 Western blot檢測(cè)腎組織NLRP3炎癥小體和炎癥因子的蛋白水平 與正常組相比，模型組NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白上調(diào)，其活化標(biāo)志物IL-1β和IL-18的表達(dá)上調(diào)，治療組比模型組顯著降低（P＜0.05），說明SDG可抑制炎癥小體的生成和炎癥因子的表達(dá)，見圖4。

5 SDG可抑制CIH小鼠腎組織氧化應(yīng)激

5.1 羥胺法和硫代巴比妥酸法分別檢測(cè)SOD的活性和MDA的含量 與正常組相比，模型組MDA的含量增高，模型組SOD的活性較正常組降低（P＜0.05），給予SDG治療后，這2項(xiàng)指標(biāo)有所恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

5.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腎組織TXNIP蛋白的表達(dá)量 TXNIP在正常組細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)很少，當(dāng)受到刺激后，模型組細(xì)胞胞漿內(nèi)明顯增多，且免疫組化IA統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，治療組胞漿內(nèi)TXNIP表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

5.3 Western blot檢測(cè)腎組織TXNIP蛋白的表達(dá)量 與正常組相比，模型組TXNIP蛋白表達(dá)顯著增多（P＜0.05），治療組與模型組相比顯著減少（P＜0.05），見圖6。

上述結(jié)果說明SDG可降低MDA水平，提高SOD活性，減少TXNIP表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激。

Figure 3 The representative images of immunohistochemical staining for NLRP3 in each group and the analysis of integral absorbance（IA）.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.圖3 各組小鼠腎臟組織NLRP3蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Figure 4.The protein expression of NLRP3，caspase-1，ASC，IL-18 and IL-1β in each group was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.圖4 各組小鼠腎臟組織中NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β蛋白表達(dá)水平

討 論

Figure 5.The representative images of immunohistochemical staining for TXNIP in each group and the analysis of integral absorbance（IA）.The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.圖5 各組小鼠腎臟組織中TXNIP的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Figure 6.The protein expression of TXNIP in each group was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.圖6 各組小鼠腎臟組織中TXNIP蛋白的測(cè)定

阻塞性睡眠呼吸暫停在臨床中最常見和最典型的癥狀是出現(xiàn)上呼吸道的部分或完全阻塞，從而表現(xiàn)出間歇性低氧的情況，因此有效的緩解間歇性低氧是治療OSA的重中之重。本研究通過建立間歇性低氧模型來模擬中重度OSA，從動(dòng)物水平研究SDG對(duì)CIH模型小鼠腎臟炎癥損傷的作用機(jī)制，為OSA的治療提供更有利的理論依據(jù)。CIH作為OSA的主要病理特征，可以引起生物體的氧化應(yīng)激，造成活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致OSA病人心、腎等器官的功能損害［7-10］，臨床主要表現(xiàn)為夜間尿量增多、腎功能低下，病理表現(xiàn)為腎小球結(jié)構(gòu)改變、腎小管上皮細(xì)胞脫落、壞死，嚴(yán)重者有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟纖維化。本研究CIH組的腎臟病理變化明顯，腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管上皮細(xì)胞脫落，甚至壞死，與李婷等［9］研究的結(jié)果一致，都是由于長(zhǎng)時(shí)間的間歇性低氧導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激造成的。李娟芝等［11］的研究已證實(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)，CIH引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的激活，參與足細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞損傷、腎小管上皮細(xì)胞損傷及腎臟纖維化，而抑制ERS的激活可以保護(hù)腎臟。Salminen等［12］發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物心、腎等器官發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，線粒體電子傳遞復(fù)合體及氮氧化物酶等會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，造成機(jī)體損傷，而應(yīng)用線粒體特異性的ROS抑制劑，可有效緩解心、腎等臟器缺血再灌注所造成的損傷。也有研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧動(dòng)物心肌組織中丙二醛水平顯著增加，且超氧化物歧化酶活性顯著降低。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，能夠反映脂質(zhì)過氧化作用的水平。SOD能清除超氧化自由基，防止細(xì)胞損傷，它的活性可以直接反映細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除能力，在維持組織細(xì)胞氧化和抗氧化平衡中起關(guān)鍵作用［13-14］。本研究通過羥胺法測(cè)定CIH小鼠腎臟組織SOD活性，發(fā)現(xiàn)SOD活性下降，表明腎組織細(xì)胞清除氧自由基能力下降。同時(shí)通過TBA法檢測(cè)腎臟組織MDA的含量，發(fā)現(xiàn)MDA含量增高，說明腎臟組織細(xì)胞發(fā)生了過氧化，間接反映間歇性低氧誘導(dǎo)了腎組織的氧化應(yīng)激，造成腎臟損傷。

TXNIP是硫氧還蛋白系統(tǒng)中的一員，在正常情況下，TXNIP與氧化型TRX-1結(jié)合抵抗組織細(xì)胞氧化應(yīng)激，而當(dāng)機(jī)體受到外界病原的氧化刺激，活性氧ROS增多，TRX-1蛋白被還原，由于TRX-1蛋白本身可形成二硫鍵，隨即與TXNIP解離，促使TXNIP與NLRP3結(jié)合，從而激活NLRP3炎癥小體，進(jìn)一步活化下游信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-18的成熟與釋放［15］。NLRP3炎癥小體是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成，由模式識(shí)別受體NLRP3、ASC及caspase-1組成［16-17］。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)源或外源性刺激（如細(xì)菌毒素、病毒基因組、氧化應(yīng)激等）時(shí)，NLRP3炎癥小體被激活，進(jìn)而活化下游信號(hào)通路，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。在本研究中，由于間接性低氧引起的氧化應(yīng)激促使TXNIP與TRX-1解離，與NLRP3結(jié)合，進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)IL-18和IL-1β的成熟與釋放，造成腎臟炎癥損傷。本文通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)得出CIH組中TXNIP和NLRP3的蛋白表達(dá)量顯著身高，炎癥因子大量產(chǎn)生，符合間歇性低氧的特征。所以抑制氧化應(yīng)激的藥物可能具有治療特定炎癥性疾病的潛力。

亞麻籽是亞麻科（Linaceae）亞麻屬（Linum）草本植物亞麻的成熟種子，其成分主要包括木酚素、油脂、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、亞麻籽膠、維生素等［18］，其中，含量最高且最主要的是木酚素，其具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和延緩衰老等作用，對(duì)人類健康有重要意義。作為天然的抗氧化劑，在醫(yī)藥方面取得很大的突破。Prasad等［19］研究發(fā)現(xiàn)對(duì)已形成AS的新西蘭兔模型中，SDG可顯著降低主動(dòng)脈MDA水平，減少主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊形成面積。Dupasquier等［20］研究表明，膳食中添加5%的亞麻籽能夠顯著抑制低密度脂蛋白受體缺失小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。王榮等［6］研究表明SDG對(duì)自由基引發(fā)劑AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞和肝組織氧化損傷有拮抗作用，其作用機(jī)制可能是通過保護(hù)紅細(xì)胞和肝組織內(nèi)抗氧化酶和抑制脂質(zhì)過氧化實(shí)現(xiàn)的。由于木酚素獨(dú)特的生物活性和多方面的藥理作用，其在炎癥和腫瘤疾病中也取得一些進(jìn)展。Teponno等［21］等的研究發(fā)現(xiàn)在食物中添加5%SDG能顯著抑制巨噬細(xì)胞標(biāo)志物MAC-3以及炎癥因子IL-6和VCAM-1的表達(dá)。Zanwar等［22］制備的大鼠心肌壞死模型研究表明，SDG能顯著減輕心肌炎癥。2017年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院批準(zhǔn)的一項(xiàng)研究顯示，SDG能減少石棉誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的NLRP3炎癥小體的表達(dá)和NF-κB的激活，再次證明SDG有明顯的抑炎作用。本研究結(jié)果顯示，CIH引起機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧或自由基，造成腎臟發(fā)生氧化損傷，腎組織NLRP3、ASC、IL-18和IL-1β蛋白，以及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α等表達(dá)顯著升高，發(fā)生炎癥反應(yīng)；當(dāng)給予SDG治療后，腎臟組織的抗氧化作用增強(qiáng)，病理炎癥反應(yīng)減輕，腎臟損傷明顯減輕。臨床OSA病人的發(fā)病原因和機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種反應(yīng)，炎癥在其中發(fā)揮著重要作用，長(zhǎng)期炎癥環(huán)境下可使組織細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)其死亡。本研究得出由于CIH所造成腎臟發(fā)生炎癥損傷的作用機(jī)制可能與TXNIP-NLRP3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，SDG能有效減輕CIH小鼠腎臟炎癥損傷，其作用機(jī)制與抗氧化、抑制炎癥有關(guān)。本研究為臨床治療OSA提供了新的思路。