氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在甲狀腺功能亢進(jìn)小鼠腎損傷中的作用*

靳貝芳， 盧欽鎮(zhèn)， 張 妍， 崔亞嵐， 強(qiáng) 鄭， 廖蔓茜， 譚慧源， 劉 昉，3△

（桂林醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，2臨床醫(yī)學(xué)院，3廣西糖尿病系統(tǒng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004）

甲狀腺功能亢進(jìn)癥（甲亢）是內(nèi)科疾病中常見且多發(fā)的內(nèi)分泌相關(guān)疾病，由機(jī)體合成和分泌過多的甲狀腺激素所引起。近年來甲亢發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且女性發(fā)病遠(yuǎn)高于男性，已成為內(nèi)分泌科僅次于糖尿病的第二大疾病［1］。甲亢會(huì)對(duì)全身系統(tǒng)造成損傷，其對(duì)腎臟的損傷已引起人們的重視［2］。有研究證明，血液中過量的甲狀腺激素可通過直接或間接作用影響腎臟生長(zhǎng)發(fā)育，造成腎結(jié)構(gòu)和功能損傷，但其中的機(jī)制尚不完全清楚［3］。

4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）是脂質(zhì)過氧化醛基產(chǎn)物中的典型物質(zhì)，也是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者［4-5］，其過量積聚會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，終究導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死等毒性反應(yīng)。之前有文獻(xiàn)報(bào)道，4-HNE在調(diào)節(jié)腎臟病中發(fā)揮重要作用，但研究主要集中在糖尿病引發(fā)的腎病綜合征中［6］，而4-HNE是否可調(diào)節(jié)甲亢誘發(fā)的腎臟病尚不清楚。

白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1（interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptorrelated factor 6，TRAF6）是炎癥調(diào)控的重要因子，我們之前的研究證明了IRAK1和TRAF6在調(diào)節(jié)甲亢性心臟病中作用突出［7］，但在甲亢性腎臟病中是否同樣具有調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究。

因此本研究采用腹腔注射過量甲狀腺素（L-thyroxine，T4）的方法建立甲亢小鼠模型，觀察T4處理對(duì)小鼠腎臟產(chǎn)生的影響，進(jìn)一步從氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)方面探究甲亢造成腎損傷的機(jī)制，為臨床干預(yù)甲亢性腎損傷提供參考。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

40只6～8周健康清潔級(jí)，體重30 g左右的雄性昆明種小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（湘）2016-0002。T4（T2376）購(gòu)自Sigma-Aldrich；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（A001-3）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（A003-1）購(gòu)自南京建成；抗4-HNE抗體（ab46545）和抗TRAF6抗體（33915）購(gòu)自Abcam；抗IRAK1抗體（4504S）和抗β-tubulin抗體（2146S）購(gòu)自CST；II抗（ZB2301）和DAB顯色試劑盒（ZLI-9081）購(gòu)自中杉金橋；ECL發(fā)光液（P10110）購(gòu)自新賽美公司；其他生物試劑使用國(guó)產(chǎn)試劑。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立 將6～8周雄性昆明小鼠適應(yīng)性（適應(yīng)環(huán)境、溫度變化）飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為甲亢模型組（T4組）和對(duì)照組，每組20只。T4組小鼠按1 mg/kg的劑量腹腔注射T4稀釋液，隔天注射1次，連續(xù)給藥7周以建立甲亢模型；對(duì)照組小鼠采用相同的方法注射等體積的生理鹽水。T4稀釋液配制：取適量T4粉末溶于含0.01 mol/L NaOH和0.1%牛血清白蛋白的溶液中，配制成2 g/L的T4母液，4℃避光保存，使用時(shí)用生理鹽水將母液稀釋10倍得到T4稀釋液。造模結(jié)束后解剖小鼠，進(jìn)行腎臟取材及脛骨長(zhǎng)度測(cè)量。用濾紙吸干水分對(duì)右側(cè)腎臟進(jìn)行拍照并稱重，以右腎重量（mg）與小鼠體重（g）的比值作為腎臟肥大指數(shù)。右腎還用于組織切片實(shí)驗(yàn)，固定于4%多聚甲醛中；左腎則用于Western blot實(shí)驗(yàn)，凍于-80℃冰箱。

2.2 HE染色 將右腎組織石蠟包埋后，切成4μm的切片，將切片脫蠟至水，進(jìn)行常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，400倍視野下觀察腎組織結(jié)構(gòu)和病理變化。

2.3 腎組織SOD活性和MDA含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取小鼠右側(cè)新鮮腎組織，按腎臟重量（g）∶勻漿液體積（mL）=1∶9的比例加勻漿液，研磨制備勻漿，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清總蛋白待測(cè)。根據(jù)試劑盒說明書操作，SOD和MDA分別在450 nm和532 nm處讀取各孔吸光度（A）值，根據(jù)相應(yīng)公式分別計(jì)算腎組織中SOD活性和MDA含量。

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 將腎組織放入RIPA裂解液中（含蛋白酶抑制劑），冰上進(jìn)行充分研磨裂解后，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清即總蛋白。使用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入loading buffer使蛋白變性。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，之后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉搖床封閉1 h。加I抗（抗4-HNE、IRAK1和β-tubulin抗體均按1∶1 000稀釋，抗TRAF6抗體按1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜。根據(jù)I抗種屬加入II抗（1∶5 000），室溫?fù)u床上孵育1 h，經(jīng)TBST充分洗掉未結(jié)合的II抗，使用ECL發(fā)光液顯影。ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-tubulin為內(nèi)參照。

2.5 免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用檸檬酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，使用3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶，5%山羊血清室溫封閉，加入抗4-HNE抗體（1∶200），4℃濕盒孵育過夜。加II抗室溫孵育，使用DAB法顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片后光鏡下觀察腎組織中4-HNE的表達(dá)情況。使用PBS替代I抗作為陰性對(duì)照組。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠腎臟基本指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

造模結(jié)束后稱量小鼠體重，發(fā)現(xiàn)T4組小鼠體重較同期對(duì)照組明顯減輕（P＜0.01）；此外，T4組小鼠腎臟體積變大，重量增加，腎臟重量/體重比（HW/BW）和腎臟重量/脛骨長(zhǎng)度比（HW/TL）明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），說明小鼠腹腔注射過量的T4可引起腎臟肥大，見圖1。

Figure 1.The changes of kidney indicators in the mice.A：body weight（BW）；B：kidney size；C：kidney weight（KW）；D：KW/BW；E：KW/tibial length（TL）.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 小鼠腎臟基本指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

2 甲亢小鼠腎臟的病理變化

腎臟組織經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常；T4組可見腎小管管腔變大，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落及空泡樣變性，腎小球萎縮等病理改變，見圖2。

3 甲亢對(duì)小鼠腎臟氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，T4組小鼠腎臟中關(guān)鍵的抗氧化酶SOD的活性顯著下降（P＜0.01），脂質(zhì)過氧化醛基產(chǎn)物MDA的含量顯著增多（P＜0.05），見圖3A、B。Western blot結(jié)果顯示，T4組小鼠腎組織中4-HNE修飾蛋白顯著增多（P＜0.05），見圖3C。進(jìn)一步用免疫組化方法檢測(cè)腎組織中4-HNE修飾蛋白的變化，同樣發(fā)現(xiàn)T4組4-HNE修飾蛋白顯著增多（P＜0.05），且在腎小管中增多較明顯，提示腎組織中腎小管損傷較嚴(yán)重，見圖3D。

Figure 2.The pathological changes of mouse kidney tissues in control group and T4 group（HE staining，×200）.Black arrows indicate renal tubular injury.圖2 小鼠腎臟組織病理的改變

Figure 3.The changes of oxidative stress indicators in the kidney tissues of mice.A and B：the levels of superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）in the kidneys；C：Western blot results of 4-HNE-modified proteins in the kidney tissues（βtubulin was used as a loading control）；D：accumulation of 4-HNE-modified proteins measured by immunohistochemical method（×400）.Neg：negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 小鼠腎臟組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化

4 甲亢小鼠腎臟中IRAK1和TRAF6蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，T4處理后小鼠腎組織中IRAK1和TRAF6蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖4。

討 論

甲亢是以代謝活躍和興奮異常增高為主要表現(xiàn)的與內(nèi)分泌相關(guān)的常見臨床疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與機(jī)體內(nèi)過量的甲狀腺激素水平有關(guān)。甲亢會(huì)對(duì)身體造成極大的危害，如果長(zhǎng)期不進(jìn)行干預(yù)治療，則會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)、循環(huán)和消化系統(tǒng)等全身多系統(tǒng)多器官發(fā)生疾?。?，8］。甲亢對(duì)腎臟的損傷已引起人們的重視，過量的甲狀腺激素可能直接作用于腎臟或通過全身血液動(dòng)力學(xué)、代謝和心血管作用間接影響腎臟，引起腎小球?yàn)V過率和腎小管重吸收率的增加，同時(shí)可伴有腎血管擴(kuò)張等病理表現(xiàn)［3］。之前有文獻(xiàn)報(bào)道炎癥在腎損傷中發(fā)揮重要作用［9］，但甲亢對(duì)腎臟造成的損傷是否也通過炎癥機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)尚無報(bào)道。因此探究甲亢造成腎損傷的發(fā)病機(jī)制，尋找甲亢靶作用于腎臟的藥物以降低其發(fā)病率尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射外源性T4的方法建立甲亢小鼠模型，結(jié)果顯示給予T4稀釋液組的小鼠體重與同期對(duì)照組相比明顯減輕，腎臟體積變大，重量增加，腎臟重量與小鼠脛骨長(zhǎng)度比值增加，說明體內(nèi)過高的甲狀腺激素水平可以誘導(dǎo)小鼠腎臟發(fā)生肥大。此外腎臟HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，T4組小鼠腎小管管腔變大，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、脫落及空泡樣變性等改變。這些結(jié)果表明腎臟是甲亢的重要受累器官，甲亢可引起明顯的腎臟損傷。

Figure 4.The protein expression of IRAK1 and TRAF6 in the kidney tissues of the mice detected by Western blot.β-tubulin was used as a loading control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4 小鼠腎臟組織中IRAK1和TRAF6蛋白表達(dá)的變化

氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多，氧化程度超過了抗氧化系統(tǒng)的清除能力，則會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。此反應(yīng)過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，會(huì)催化裂解產(chǎn)生醛基產(chǎn)物MDA，其毒性作用給細(xì)胞造成不可逆的損傷，通過凋亡或壞死的方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［10-11］；而SOD為機(jī)體主要的自由基抗氧化清除酶之一，其活性程度可反應(yīng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激水平。在本研究中，血液中過量的甲狀腺激素可導(dǎo)致腎組織中SOD活性下降，MDA醛基產(chǎn)物和4-HNE修飾蛋白增多，說明過量的甲狀腺激素增加了小鼠體內(nèi)的氧化損傷程度。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因，可能與甲狀腺激素本身的代謝調(diào)節(jié)作用有關(guān)［12］。過量的甲狀腺激素通過誘導(dǎo)特定的線粒體酶加速基礎(chǔ)代謝率和氧化代謝，這些酶可以直接與ROS結(jié)合［13-14］，產(chǎn)生包括4-HNE在內(nèi)的有毒醛類物質(zhì)。因此我們推測(cè)小鼠體內(nèi)4-HNE修飾蛋白的增多，增加了細(xì)胞毒性，破壞了腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致腎臟細(xì)胞受損。降低氧化損傷水平，可能會(huì)在一定程度上緩解甲亢引起的腎損傷。

之前有研究報(bào)道，4-HNE可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［15-16］，且炎癥作為腎損傷機(jī)制的相關(guān)研究也引起研究者的興趣。IRAK1是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的相關(guān)因子，也是可參與到Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號(hào)傳導(dǎo)通路等炎癥反應(yīng)過程中的重要促炎因子［17］。TRAF6是TLR家族成員之一，是炎癥調(diào)控相關(guān)因子，通過介導(dǎo)炎癥和凋亡信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答［18］。本研究結(jié)果顯示，T4組小鼠腎臟中IRAK1和TRAF6蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，這說明甲亢小鼠腎組織炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，IRAK1和TRAF6在共同調(diào)控甲亢性腎損傷中發(fā)揮著重要作用。不少研究報(bào)道，當(dāng)TLR4受體相關(guān)因子作用被激活時(shí)，IRAK1可與TRAF6結(jié)合使其活化，進(jìn)一步激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），從而形成 IRAK1/TRAF6/NF-κB通路發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用［19-21］。此外，NF-κB的激活可調(diào)節(jié)下游TNF-α、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-10等各種炎癥細(xì)胞因子，從而實(shí)現(xiàn)IRAK1和TRAF6對(duì)炎癥通路的調(diào)控［7］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了過量甲狀腺激素導(dǎo)致4-HNE修飾蛋白增多，4-HNE通過IRAK1和TRAF6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)機(jī)制激活炎癥相關(guān)通路，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠腎損傷的正向調(diào)控作用。因此，本研究證明了過量的甲狀腺激素造成小鼠腎臟損傷的機(jī)制可能與氧化應(yīng)激水平升高和炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。