原鈣黏蛋白10通過NF-κB/cyclin D1信號通路抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖*

岳麗玲， 劉 溪， 張 微， 于海濤， 劉立琨， 高秀麗， 朱文斌， 李 娜

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)藥科學(xué)研究院，2附屬第三醫(yī)院乳腺外科，黑龍江齊齊哈爾161006）

我國乳腺癌發(fā)病率位居女性腫瘤發(fā)病率榜首，且發(fā)病呈逐年上升和年輕化趨勢［1］。雖然乳腺癌的診治目前已取得長足的進展，但其高發(fā)病率及治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍嚴重威脅著患者的生存。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)病機制，探尋新的腫瘤分子標志物成為研究的重點。

原鈣黏蛋白10（protocadherin 10，PCDH10）是鈣黏蛋白家族的新成員，早期有關(guān)PCDH10的研究主要集中于神經(jīng)元疾病，如自閉癥［2］。最近的研究表明，PCDH10經(jīng)常因其啟動子區(qū)高甲基化而失活，并在胃癌、大腸癌和肺癌以及其他腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用［3-6］。此外，過度表達PCDH10能夠抑制包括鼻咽癌、食道癌和結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞生長［7］。然而，關(guān)于乳腺癌中PCDH10表達的研究非常有限，僅有報道PCDH10在乳腺癌中發(fā)生異常甲基化［8-9］，但是PCDH10在乳腺癌細胞中的表達、生物學(xué)功能和機制仍未闡明。因此，本研究通過檢測乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞MCF-10A中PCDH10的表達情況，體外建立PCDH10穩(wěn)定過表達細胞，并分析PCDH10對乳腺癌細胞增殖和細胞周期的影響及分子機制，以探討PCDH10在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用途徑。

材料和方法

1 細胞株

人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、ZR-75-1和Bcap37及人正常乳腺上皮細胞MCF-10A均購自中科院上海細胞庫。

2 主要試劑

L-15培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清（HyClone）；MEBM培養(yǎng)液（LONZA）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；PCR試劑盒（TaKaRa）；兔抗人PCDH10多克隆抗體（Proteintech）；兔抗人細胞周期蛋白D1（cyclin D1）單克隆抗體、細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）單克隆抗體、磷酸化核因子κB（nucear factor-κB，NF-κB）p65 亞 基（phosphorylated p65，p-p65）單克隆抗體和磷酸化NF-κB抑制蛋白α（phosphorylated NF-κB inhibitor α，p-IκBα）單克隆抗體（CST）；鼠抗人GAPDH單克隆抗體（CST）；MTT粉劑（Sigma）；細胞周期檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；PCDH10慢病毒過表達載體由本實驗室構(gòu)建；PCDH10引物序列由上海生工生物工程公司合成。

3 實驗方法

3.1 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液，ZR-75-1和Bcap37細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液，MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于L-15培養(yǎng)液，MCF-10A細胞培養(yǎng)于MEBM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中均含有10%的胎牛血清；除MDA-MB-231細胞不需CO2外，所有細胞均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長。

3.2 RT-PCR檢測PCDH10在乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞中的表達 采用Trizol法分別提取各細胞總RNA，取500 ng總RNA進行RT-PCR擴增。PCDH10的上游引物序列為5'-ACTGCTATCAGGTATGCCTG-3'，下游引物序列為5'-GTCTGTCAACTAGATAGCTG-3'，擴增產(chǎn)物長度為219 bp；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，下游引物序列為5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'，擴增產(chǎn)物長度為303 bp。PCR條件：94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35次循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

3.3 RT-PCR及Western blot法驗證MDA-MB-231細胞慢病毒感染效果 胰酶消化MDA-MB-231細胞，在24孔板每孔中加入5×104個細胞，細胞80%以上融合時進行病毒感染。以預(yù)實驗得到的重組慢病毒載體pLV-PCDH10的最佳MOI值100感染MDA-MB-231細胞，8 h后更換細胞上清為新鮮培養(yǎng)液，加入2 mg/L的嘌呤霉素篩選1周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCDH10的MDA-MB-231細胞，命名為pLV-PCDH10細胞；同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染的空白對照（blank）組和轉(zhuǎn)染病毒空載體的陰性對照（pLV-NC）組細胞。分別提取各組細胞總RNA與總蛋白，RT-PCR和Western blot法分別檢測PCDH10在各組細胞中的mRNA和蛋白表達。

3.4 MTT法分析細胞增殖能力 取處于對數(shù)生長期的pLV-NC組和pLV-PCDH10組細胞，分別以每孔3×103個細胞接種于96孔板，每組設(shè)4個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后加入20μL的MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150μL的DMSO，避光震蕩10 min后酶標儀490 nm波長處測定吸光度（A）值，繪制細胞生長曲線圖。

3.5 平板集落形成實驗 收集pLV-NC及pLVPCDH10組細胞，計數(shù)，按每孔1.5×103個細胞接種于6孔板中，每組細胞設(shè)3個復(fù)孔。37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2周，甲醇固定15 min，PBS洗去固定液，加入0.2%結(jié)晶紫染色20 min，流水緩慢沖去染液，室溫干燥。計數(shù)集落數(shù)，并按以下公式計算集落形成率：集落形成率（%）=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

3.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將轉(zhuǎn)染細胞按每孔5×105個接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)過夜。收集各組細胞，預(yù)冷PBS洗1次，加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。PBS洗滌2次，然后加入100μL的RNase A 37℃水浴30 min，再加入400μL PI染液，重懸細胞，4℃避光反應(yīng)30 min，流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化。

3.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 收集pLV-NC組和pLV-PCDH10組細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取20μg蛋白進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h后加入I抗［PCDH10（1∶800）、cyclin D1（1∶1 000）、CDK4（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、p-IκBα（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）］4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入II抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后ECL顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)成像。以GAPDH作為內(nèi)參照，檢測各蛋白條帶吸光強度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

各組實驗重復(fù)3次，所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳腺癌細胞中PCDH10基因的表達

RT-PCR結(jié)果顯示，PCDH10基因在MDA-MB-231、MCF-7、ZR-75-1和Bcap37這4種乳腺癌細胞中的表達水平均低于正常乳腺上皮細胞MCF-10A，且在MDA-MB-231和Bcap37細胞中表達水平最低（P＜0.01），見圖1。

2 慢病毒感染MDA-MB-231細胞后PCHD10的mRNA和蛋白表達上調(diào)

感染pLV-PCDH10慢病毒載體的MDA-MB-231細胞經(jīng)嘌呤霉素篩選后，RT-PCR和Western blot法驗證效果。結(jié)果顯示，pLV-PCDH10組細胞PCDH10的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于blank組及pLV-NC組（P＜0.05），而PCDH10在blank組及pLVNC組中的mRNA和蛋白表達水平無顯著差異（P＞0.05），見圖2。后續(xù)實驗選取同樣感染慢病毒的pLV-NC組作為pLV-PCDH10組的陰性對照。

Figure 1.The expression of PCDH10 mRNA in breast cancer cell lines and normal mammary epithelial MCF-10A cells detected by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs MCF-10A cells.圖1 乳腺癌細胞與正常人乳腺上皮MCF-10A細胞中PCDH10的mRNA表達水平

3 過表達PCDH10可抑制MDA-MB-231細胞增殖

MTT結(jié)果顯示，pLV-NC組細胞生長旺盛，而接種48 h后穩(wěn)轉(zhuǎn)pLV-PCDH10組細胞活力顯著低于pLV-NC組（P＜0.05），見圖3A；集落形成實驗結(jié)果顯示，pLV-PCDH10組細胞集落形成率（12.27%）遠低于pLV-NC組（31.87%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

4 過表達PCDH10影響MDA-MB-231細胞周期分布

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，pLV-PCHD10組細胞G0/G1期細胞比例（57.46%）高于pLV-NC組（47.04%），差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＜0.05）；與 pLV-NC 組（30.01%）相比，pLV-PCHD10組S期細胞比例（23.90%）顯著降低（P＜0.05），見圖4。

5 過表達PCDH10對MDA-MB-231細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

通過Western blot檢測周期相關(guān)蛋白cyclin D1和CDK4的表達，結(jié)果顯示，與pLV-NC組相比，pLVPCHD10組細胞cyclin D1和CDK4蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

Figure 2.PCDH10 expression was signifcantly increased in MDA-MB-231 cells transfected with pLV-PCDH10.A：the mRNA expression of PCDH10 was detected by RT-PCR；B：the protein expression of PCDH10 was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs blank group or pLV-NC group.圖2 轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細胞中PCDH10的mRNA和蛋白表達水平

Figure 3.Overexpression of PCDH10 inhibited the proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells in vitro.A：the cell viability was measured by MTT assay；B：the growth of the cells was detected by colony formation assay.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs pLV-NC group.圖3PCDH10過表達對MDA-MB-231細胞增殖的影響

6 過表達PCDH10對NF-κB和IκBα蛋白表達的影響

利用Wetern blot檢測過表達PCDH10細胞中磷酸化NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達變化。結(jié)果顯示，與pLV-NC組相比，pLV-PCDH10組中NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.01），見圖6。

討 論

Figure 4.PCDH10 overexpression induced MDA-MB-231 cell cycle arrest at G1phase.The distribution of cell cycle was analyzed by fl ow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs pLV-NC group.圖4 PCDH10過表達對MDA-MB-231細胞周期的影響

Figure 5.PCDH10 overexpression suppressed the expression of cell cycle-related proteins cyclin D1 and CDK4.The protein expression levels of cyclin D1 and CDK4 were examined by Western blot.GAPDH was used as an internal loading control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs pLV-NC group.圖5 過表達PCDH10對cyclin D1及CDK4蛋白表達的影響

PCDH10基因位于人類染色體4q28.3，屬于原鈣黏連蛋白家族的成員，在細胞間的信息傳遞、細胞黏附和分化等方面發(fā)揮重要作用；還在神經(jīng)細胞中參與軸突引導(dǎo)，影響神經(jīng)元活性，維持神經(jīng)回路穩(wěn)定及細胞形成的功能［10-11］。最近的研究認為，PCDH10是一種新型的腫瘤抑制基因，在肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、宮頸癌等多種實體腫瘤中表現(xiàn)出表觀遺傳學(xué)沉默作用［12］，并與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［13-14］。PCDH10的表達和甲基化狀態(tài)異常還與肝癌［15］、胰腺癌［16］患者預(yù)后相關(guān)，PCDH10表達的下調(diào)預(yù)示著預(yù)后不良。這些研究表明PCDH10在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。Liu等［9］報道乳腺癌患者PCDH10發(fā)生異常甲基化，而PCDH10在乳腺癌細胞中具體發(fā)揮的生物學(xué)作用及其相關(guān)分子機制尚不清楚。

Figure 6.PCDH10 overexpression suppressed the phosphorylation of NF-κB p65 and IκBα in MDA-MB-231 cells.The phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα were detected by Western blot.GAPDH was used as an internal loading control.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs pLV-NC group.圖6 過表達PCDH10對MDA-MB-231細胞NF-κB和IκBα蛋白的影響

本研究通過RT-PCR檢測顯示，MDA-MB-231、MCF-7、ZR-75-1和Bcap37這4種乳腺癌細胞中PCDH10的mRNA表達水平均低于正常乳腺上皮MCF-10A細胞，提示PCDH10在乳腺癌細胞中存在表達下調(diào)或者缺失。我們將PCDH10慢病毒過表達載體成功轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細胞進一步研究PCDH10對乳腺癌細胞功能的影響。細胞增殖能力的分析顯示，PCDH10過表達可抑制細胞生長，降低細胞增殖能力，提示PCDH10可能參與乳腺癌細胞增殖的調(diào)控。Ying等［7］證實PCDH10過表達可以減少非小細胞肺癌H1650和H1975細胞的增殖和遷移；在肝癌細胞中，PCDH10的上調(diào)抑制HepG2和HuH7細胞增殖及集落形成［17］。我們的結(jié)果與這些研究結(jié)果相一致，表明PCDH10能夠影響腫瘤細胞的增殖。

真核細胞通過調(diào)控細胞周期維持機體的正常代謝和增殖，細胞周期調(diào)控紊亂使腫瘤細胞異常增殖是腫瘤的基本特征［18］。因此，我們進一步檢測了PCDH10過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞周期的影響，結(jié)果表明PCDH10過表達可引起G0/G1期細胞周期阻滯，使進入S期的細胞比例減少，從而抑制細胞增殖。細胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1能夠在G1期達到表達峰值，是細胞周期啟動因子，可與CDK4/6結(jié)合，介導(dǎo)G1到S期的轉(zhuǎn)換，當我們評估PCDH10過表達后cyclin D1和CDK4表達水平時，發(fā)現(xiàn)二者的蛋白表達量均減少。這表明PCDH10可通過阻滯細胞周期而抑制乳腺癌細胞增殖。

NF-κB是一個存在于真核細胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，在人類多種惡性腫瘤均觀察到NF-κB p65活化，并在腫瘤細胞的增殖分化、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［19］。有研究報道，PCDH10通過抑制NF-κB途徑誘導(dǎo)骨髓瘤細胞凋亡［20］。我們觀察到在MDAMB-231細胞中過表達PCDH10可使NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平下調(diào)。IκB是NF-κB的主要調(diào)控抑制蛋白，其磷酸化使NF-κB激活，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄［21］，這表明PCDH10能夠抑制NF-κB的活性。Hinz等［22］研究表明cyclin D1為NF-κB下游靶基因，其啟動子上存在NF-κB結(jié)合的位點，當NF-κB表達激活過程被阻滯后，cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄表達受抑制，導(dǎo)致細胞周期延遲［23］。因此，我們的結(jié)果表明，PCDH10可通過抑制NF-κB p65和IκB的磷酸化阻斷NF-κB激活，從而下調(diào)cyclin D1等細胞周期相關(guān)蛋白表達，使細胞周期調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致乳腺癌細胞的生長增殖受到抑制。

綜上所述，PCDH10基因能夠抑制乳腺癌細胞的增殖，其作用可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB/cyclin D1信號通路途徑，影響細胞周期而發(fā)揮抑癌功能。