I類新藥YHR46化學殘留分析方法的建立

賴品甜 曹穗嫻(揚子江藥業(yè)集團廣州海瑞藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510663)

0 引言

YHR46是自主創(chuàng)新的I類化學新藥。糖尿病動物模型研究發(fā)現(xiàn)，YHR46療效顯著，能夠明顯降低血糖水平、有效保護腎臟組織和胰島β細胞。本文采用高效液相色譜法建立了建立YHR46化學殘留檢測方法。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

YHR46對照品：來源于上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司，磷酸氫二鈉、乙腈(色譜級)、異丙醇、純化水。

1.2 儀器

高效液相色譜儀型號為Agilent1260，電子天平為梅特勒XS205。

2 擦拭方法摸索

2.1 化學殘留限度及擦拭面積確定

根據(jù)《YHR46清潔驗證前期評估表》，YHR46活性成分-YHR46殘留限度為2.91μg/cm2，根據(jù)確定的相應(yīng)設(shè)備取樣位置可知，擦拭面積約為25cm2，提取體積擬定為5mL，因此化學殘留限度濃度為14.55μg/mL(殘留限度×擦拭面積/提取體積)。

2.2 擦拭材質(zhì)及工具確定

根據(jù)《YHR46清潔驗證前期評估表》，本次清潔驗證設(shè)計的設(shè)備材質(zhì)分別為不銹鋼和陶瓷，而不銹鋼為大部分設(shè)備的材質(zhì)，因此采用不銹鋼進行擦拭方法摸索，后對陶瓷材質(zhì)進行擦拭回收率的確認，最后對不銹鋼和陶瓷兩種材質(zhì)進行系統(tǒng)的方法學驗證。

擦拭工具：進行擦拭取樣時，選擇的擦拭工具為無紡布凈化棉簽。無紡布凈化棉簽?zāi)苣褪芤话阌袡C溶劑的溶解，并且不會脫落纖維，故在使用前用清潔溶劑浸潤即可。

2.3 溶劑的篩選

稀釋劑A：分別量取水500mL和異丙醇500mL，混勻，即得水-異丙醇(50:50)。

稀釋劑B：分別量取水800mL和乙腈200mL，混勻，即得水-乙腈(80:20)。

對照品溶液：精密稱取YHR46對照品14.5mg，置100mL棕色量瓶中，加入稀釋劑使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液SST，再精密量取1mL置于10mL棕色量瓶中，加稀釋劑至刻度，搖勻，即為對照品溶液(14.5μg/mL)。

對稀釋劑A和稀釋劑B，以及對應(yīng)稀釋劑配制的對照品溶液進行進樣，結(jié)果中稀釋劑A和稀釋劑B空白圖譜無干擾峰，基線平穩(wěn)，用稀釋劑A和稀釋劑B配制的對照品溶液理論塔板數(shù)均大于2000，拖尾因子分別為1.07和1.12，因此選擇稀釋劑A：水-異丙醇(50:50)作為稀釋劑。

2.4 過濾濾頭的吸附影響考察

選取用稀釋劑A所配制的對照品溶液，精密量取5mL于注射器中，用聚四氟乙烯濾頭進行過濾，棄去1mL、2mL、3mL，取續(xù)濾液進樣，過濾樣品的主峰峰面積與未過濾的峰面積進行對比，比值應(yīng)在0.98～1.02之間，結(jié)果如表1所示。根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，以各過濾樣品的主峰峰面積與未過濾的峰面積進行對比，比值均在0.98～1.02，無明顯差異，選取棄去溶液體積2mL。

2.5 提取溶劑的確定

精密量取對照品儲備溶液(兩份)分別滴加在兩根干燥的無紡布棉簽上，自然晾干或使用電吹風溫和吹干，剪斷擦拭棉簽頭，將同一份滴加溶液的棉簽頭放入同一個取樣瓶中，共兩個瓶，精密加入提取溶劑(分別是稀釋劑A和稀釋劑B)5mL，加蓋，5℃下超聲20min，過濾，取濾液測定。各提取溶劑的回收率應(yīng)不低于50%，檢測結(jié)果如表2所示。由表2可知，稀釋劑A和稀釋劑B作為提取溶劑，回收率分別為89%和88%，因此選擇稀釋劑A作為提取溶劑。

表1 三種棄去溶液體積對比結(jié)果

表2 兩種稀釋劑檢測結(jié)果

2.6 超聲時間的確定

以稀釋劑A作為提取溶劑配制對照品貯備液，分別考察5℃下超聲10min、15min、20min后，過濾，取續(xù)濾液測定。樣品的提取回收率應(yīng)不低于50%，選取回收率較大的超聲時間作為最終的超聲時間檢測結(jié)果如表3所示。

由表3可知，5℃下超聲10min、15min、20min回收率分別為88%、88%、89%，考察5℃下超聲20min回收率較大，選擇樣品的超聲時間為20min。

2.7 擦拭溶劑的確定

根據(jù)本YHR46的理化性質(zhì)，其在甲醇、乙醇、乙腈和0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH中易溶，在水中極易溶解，且考慮到車間的清洗情況，本次選擇純化水、乙醇作為篩選的擦拭溶劑，在上述選定的稀釋劑、提取溶劑、超聲時間、過濾體積的基礎(chǔ)上，對不銹鋼板進行擦拭操作。擦拭回收率應(yīng)不低于50%，兩種擦拭溶劑進行比較，選取回收率較高的作為擦拭溶劑，若二者無明顯差異，則首選純化水作為擦拭溶劑，檢測結(jié)果如表4所示。從表4可知，擦拭溶劑為純化水及乙醇，樣品回收率分別為89%、89%，兩者之間無明顯差異，且均不低于50%，因此選擇純化水作為擦拭溶劑。

通過以上擦拭方法摸索，基本確定了YHR46化學殘留提取方法，以稀釋劑A作為溶劑及提取溶劑，用聚四氟乙烯濾頭進行過濾，棄去2mL，5℃下超聲20min，選擇純化水作為擦拭溶劑。

3 方法學研究

3.1 專屬性試驗

取溶劑空白溶液、空白擦拭樣品溶液、對照溶液分別在規(guī)定色譜條件下進樣，采集空白溶液、空白擦拭樣品溶液、對照溶液圖譜，空白溶液以及空白擦拭樣品溶液無與對照品溶液中主峰(YHR46)保留時間相同或相近(保留時間±5%)的色譜峰。

3.2 系統(tǒng)適用性試驗

取對照品溶液連續(xù)進樣6次，主峰(YHR46)保留時間的RSD為0.2%(標準RSD≤2.0%)，主峰(YHR46)峰面積的RSD為0.05%(標準RSD≤5.0%)。

3.3 檢測限和定量限

取對照品溶液，稀釋后進樣，信噪比為10:1時為定量限，信噪比為10:1時為檢測限，檢測限濃度為0.0068736μg/mL，定量限濃度為0.022912μg/mL。

3.4 線性范圍

分別對照品儲備液溶液1mL、2mL、2mL、3mL、4mL分別置20mL、25mL、20mL、25mL、20mL容量瓶中，加稀釋劑至刻度，得到5個濃度樣品溶液(分別相當于殘留限度50%、80%、100%、120%、200%)[1]，上述各濃度樣品及LOQ樣品各進樣1次，對本方法的線性進行考察，結(jié)果如表5所示。

表3 三種超聲時間檢測結(jié)果

表4 兩種擦拭溶劑檢測結(jié)果

表5 六種濃度樣品考察結(jié)果

由試驗結(jié)果可知，主成分在0.022912～28.64μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性，線性方程為y=1.92191×10-5x-0.0233709，r為0.999972(標準r≥0.999)。

3.5 擦拭取樣回收率

在不銹鋼板以及陶瓷板上用鉛筆劃出5cm×5cm的區(qū)域，劃出10塊。每方塊間隔不小于2cm，精密移取對照品儲備液SST0.4mL(3份)、0.5mL(3份)、0.6mL(3份)，每份盡量均勻地涂在一個5cm×5cm的正方形上，共涂布9份。自然干燥或用電吹風溫和地吹干。

用純化水潤濕擦拭棉簽，剪將擦拭同一方塊的棉簽頭放入同一個取樣瓶中，共9個瓶，精密加入水-異丙醇(50:50)5mL，蓋上蓋子，5℃超聲20min，用聚四氟乙烯濾頭濾過，棄去2mL，取濾液及對照品溶液各10μL測定，記錄色譜圖，按外標法計算，擦拭回收率及其回收率的RSD%。不銹鋼板和陶瓷板測試結(jié)果如表6和表7所示。

由試驗結(jié)果可知，不銹鋼板及陶瓷板的擦拭取樣回收率分別為76%、78%，RSD分別為4%、3%。

3.6 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液及對照品溶液分別于5℃條件下放置0h、4h、8h、12h、24h后，以0h為100%計算相對回收率，結(jié)果如表8所示。從表8顯示，回收率均在98%～102%之間，對照品溶液、供試品溶液(陶瓷板和不銹鋼板)在24h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 不銹鋼板測試結(jié)果

表7 陶瓷板測試結(jié)果

表8 五個不同時間測試結(jié)果

4 結(jié)語

本方法測定結(jié)果準確，專屬性好；YHR46化學殘留在0.022912～28.64μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性，不銹鋼板擦拭回收率為76%(RSD=4%)，陶瓷板擦拭回收率為78%(RSD=3%)，能有效檢出YHR46化學殘留的量，可以作為YHR46中化學殘留檢測方法。