河南鄭州地區(qū)奶牛源安氏隱孢子蟲蟲種鑒定及多位點序列分型研究

鄭雙健，李東方，陳遠才，曹樂天，王璐陽，黃建營，劉東海，李 豪，張龍現(xiàn)*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院 河南省人獸共患病國際聯(lián)合實驗室，河南 鄭州 450046；2.河南省奶牛生產(chǎn)性能測定有限公司，河南 鄭州 450046)

1971年P(guān)ANCIER等[1]首次報道牛隱孢子蟲(Cryptosporidiumandersoni，C.andersoni)病，引起世界各地廣泛關(guān)注[2]。目前，隱孢子蟲有37個有效種被鑒定出來[3-5]，以牛為自然宿主的隱孢子蟲主要包括：微小隱孢子蟲(C.parvum)、牛隱孢子蟲(C.bovis)、瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)和安氏隱孢子蟲(C.andersoni)，其中微小隱孢子蟲(C.parvum)主要感染斷奶前犢牛;牛隱孢子蟲(C.bovis)和瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)主要感染斷奶后犢牛;而安氏隱孢子蟲(C.andersoni)主要感染青年牛和成年牛。因上海浦東地區(qū)某醫(yī)院腹瀉病人和江蘇某門診病人體內(nèi)的暴發(fā)[6-7]，C.andersoni引起人們關(guān)注。

然而，由于C.andersoni與鼠隱孢子蟲(C.muris)在形態(tài)上非常相似，直至2000年，C.andersoni才被LINDSAY等[8]通過對其傳播研究及分子生物學(xué)研究命名為一新物種。C.andersoni的準確鑒定仍然依賴于分子手段。本研究通過對鄭州地區(qū)奶牛隱孢子蟲進行顯微鏡檢測及C.andersoni不同亞型分子鑒定，以期了解鄭州地區(qū)奶牛隱孢子蟲的感染情況及C.andersoni的亞型分布情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集于2017年12月28日—2018年1月18日，分多次對河南省鄭州地區(qū)3個奶牛場不同年齡段奶牛進行直腸采樣，共收集新鮮糞便樣品973份，其中包括：奶牛場A共采集685份(0～2月齡169份、3～6月齡4份、7～13月齡161份、14月齡產(chǎn)犢前116份、泌乳牛235份)，奶牛場B和奶牛場C分別采集49份和239份(均為泌乳牛)。每份樣品約20 g，分別裝入潔凈的一次性手套內(nèi)并記錄基本信息，如：牛號、養(yǎng)殖方式、年齡、臨床癥狀、廠區(qū)防疫等，并于當(dāng)天帶回實驗室保存在4℃冰箱中，48 h內(nèi)進行顯微鏡檢測。

1.2 顯微鏡檢測采用離心沉淀法和飽和蔗糖溶液漂浮法對樣品進行處理，然后使用顯微鏡對隱孢子蟲卵囊進行形態(tài)學(xué)鑒定[9]。

1.3 DNA提取稱取200 mg糞便樣品，嚴格按照糞便DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Stool DNA Kit,D4015-02)說明進行操作，試劑盒購自鄭州科貿(mào)生物技術(shù)有限公司，提取DNA保存于-20℃保存。

1.4 PCR擴增分別基于SSU rRNA[10-11]、Actin[12]、HSP70[13]和COWP[14]基因位點對隱孢子蟲進行蟲種鑒定，再分別基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16[15]基因位點對隱孢子蟲進行亞型鑒定。不同基因位點PCR引物序列、退火溫度和目的片段大小見表1，除使用ExTaq酶對COWP基因以及使用KOD-Plus酶對HSP70基因進行共計1輪PCR擴增外，其他基因位點均使用KOD-Plus酶進行巢氏PCR擴增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，KOD-plus酶(日本TOYOBO公司)和ExTaq酶(日本TaKaRa公司)購自鄭州科貿(mào)生物技術(shù)有限公司。

1.5 測序PCR產(chǎn)物測序由鄭州擎誠生物科技有限公司進行雙端測序，將得到測序結(jié)果根據(jù)測序圖譜進行堿基序列校正，拼接完成后在GenBank上進行同源序列搜索，使用軟件Clustal X 2.13(http://www.clustal.org/)進行比對分析，以對隱孢子蟲蟲種進行鑒定，再根據(jù)FENG等[15]和WANG等[16]的重復(fù)序列進行MLST亞型鑒定。

1.6 種系發(fā)育關(guān)系分析使用Mega7.0(https://www.megasoftware.net)軟件對進化樹進行構(gòu)建，采用鄰接法(Neighbour-joining)對其進行種系發(fā)育分析，設(shè)置1 000個重復(fù)，所需基因序列下載自GenBank。

1.7C.andersoni卵囊測定依次采用離心沉淀法、蔗糖密度梯度離心法[17]和氯化銫密度梯度離心法[18]對陽性樣品進行卵囊純化處理，使用微分干涉顯微鏡進行拍照及測定卵囊的長、寬和卵囊指數(shù)(長/寬)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用χ2檢驗分別對不同年齡段和不同采樣地點奶牛隱孢子蟲感染情況差異顯著性進行分析，再采用單因素方差分析對C.andersoni不同MLST亞型卵囊的長、寬和卵囊指數(shù)(長/寬)差異顯著性進行分析，P<0.05差異顯著。

表1 引物的序列及退火溫度

2 結(jié)果

2.1 河南鄭州地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況隱孢子蟲總感染率為2.77%(27/973)。不同年齡段之間隱孢子蟲感染率差異顯著(P<0.05)，且以斷奶前犢牛感染率最高7.10%(12/169)，其他年齡段均處于較低感染水平，如：育成牛0.62%(1/161)、青年牛3.45%(4/116)、泌乳牛1.91%(10/523)，而在斷奶后犢牛未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染。此外，3個奶牛場之間隱孢子蟲感染率差異不顯著(P>0.05)，僅在奶牛場A和C發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染，感染率分別為2.77%(19/685)和3.35%(8/239)，而在奶牛場B未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染(表2)。

表2 河南鄭州地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況

2.2 隱孢子蟲的蟲種鑒定經(jīng)顯微鏡形態(tài)學(xué)鑒定為C.andersoni的8份泌乳牛糞便樣品分別基于隱孢子蟲SSU rRNA、Actin、HSP70和COWP基因進行PCR擴增，均成功擴增出目的片段，大小分別約為840，818，494，500 bp(圖1)。8份樣品在各個位點均被成功測序，拼接后序列比對結(jié)果均顯示為C.andersoni陽性，僅在HSP70基因位點存在1個堿基差異。

圖1 隱孢子蟲SSU rRNA、Actin、HSP70和COWP基因PCR擴增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker；1～8.樣品；P.陽性對照；N.陰性對照

2.3C.andersoni的MLST亞型鑒定經(jīng)分子鑒定為C.andersoni的8份DNA樣品分別基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16 4個位點進行PCR擴增，均成功擴增出目的片段，目的片段大小分別約為550，457，536，597 bp(圖2)。8份樣品在各個位點均被成功測序，拼接后序列比對結(jié)果顯示均被成功分型，分別在CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16 4個基因位點分別鑒定出3，2，2，1個亞型，共形成4個MLST亞型，其中A4、A4、A4和A1為優(yōu)勢MLST亞型，分布于3頭奶牛中；A6、A4、A2和A1為新MLST亞型，分布于2頭奶牛中；A4、A5、A4和A1分布于2頭奶牛中以及A2、A4、A2和A1分布于1頭奶牛中。進化樹分析結(jié)果與序列比對分析結(jié)果一致(圖3)。

2.4C.andersoni不同MLST亞型的卵囊測定卵囊測定結(jié)果顯示：卵囊呈圓形或橢圓形，C.andersoni卵囊大小為：(7.40±0.55) μm ×(5.99±0.49) μm，卵囊指數(shù)為1.24±0.11。C.andersoni不同MLST亞型卵囊的長、寬和卵囊指數(shù)(長/寬)差異顯著(P<0.05)，不同亞型卵囊大小如下：MLST亞型A4、A4、A4和A1為：(7.46±0.55) μm ×(5.93±0.58) μm，卵囊指數(shù)為1.27±0.11；MLST亞型A6、A4、A2和A1為：(7.37±0.52) μm ×(6.06±0.47) μm，卵囊指數(shù)為1.22±0.12；MLST亞型A2、A4、A2和A1為：(7.55±0.61) μm ×(6.15±0.35) μm，卵囊指數(shù)為1.23±0.12；MLST亞型A4、A5、A4和A1為：(7.26±0.53) μm ×(5.94±0.36) μm，卵囊指數(shù)為1.23±0.10(表3)，不同分離株部分卵囊見圖4。

圖2 C.andersoni 4個基因位點部分PCR擴增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker；1～4.CM-MS1位點；5～8.CM-MS2位點；9～12.CM-MS3位點；13～16.CM-MS16位點；P1～P4.陽性對照；N1～N4.陰性對照

圖3 基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16 4個基因序列構(gòu)建的鄰接進化樹

表3 C.andersoni蟲分離株的卵囊測定 μm

圖4 部分C.andersoni的卵囊 A.1066樣品；B.3023樣品；C.3037樣品；D.1067樣品；E.2006樣品；F.3056樣品；G.9038樣品；H.722樣品

3 討論

本次對河南鄭州地區(qū)奶牛隱孢子蟲調(diào)查發(fā)現(xiàn)，總體處于較低感染水平，總感染率為2.77%(27/973)，低于廣東(4.38%，63/1 440)[19]、廣西(8.16%，35/429)[20]、上海(13.65%，67/491)[21]、江蘇(19.09%，251/1 315)[21]以及臺灣(37.61%，173/460)[22]，但是高于甘肅(1.85%，42/2 276)[23]地區(qū)。此外，本研究也與WANG等[24]發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染率隨著奶牛年齡的增長而呈現(xiàn)下降的結(jié)論基本一致。研究發(fā)現(xiàn)，在我國奶牛中存在多種不同隱孢子蟲混合感染組合現(xiàn)象[25]，如：C.parvum+C.bovis、C.parvum+C.ryanae、C.parvum+C.andersoni以及C.bovis+C.ryanae，然而在本研究中未檢測出混合感染現(xiàn)象。不同地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況存在差異的原因很多，可能與不同的檢測手段、地理環(huán)境、養(yǎng)殖模式等因素有關(guān)。

基因gp60作為對隱孢子蟲亞型鑒定的常見位點，主要集中于微小隱孢子蟲(C.parvum)和人隱孢子蟲(C.hominis)的群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析，卻無法對C.andersoni進行亞型鑒定。自2011年ENG等[15]基于C.muris基因組數(shù)據(jù)建立C.andersoni4個基因位點CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16的MLST分型工具之后，目前研究表明國內(nèi)奶牛源C.andersoni共發(fā)現(xiàn)20種MLST亞型結(jié)構(gòu)：A1、A2、A4、A1，A1、A4、A2、A1，A1、A4、A4、A1，A2、A1、A2、A1，A2、A1、A3、A1，A2、A4、A2、A1，A2、A4、A4、A1，A2、A5、A2、A1，A2、A6、A2、A1， A2、A7、A4、A1，A3、A4、A4、A1，A4、A4、A2、A1，A4、A4、A4、A1，A4、A4、A5、A1，A4、A5、A2、A1，A4、A5、A4、A1，A4、A8、A4、A1，A4、A9、A4、A1，A5、A4、A4、A1和A7、A4、A4、A1，其中多數(shù)研究表明A4、A4、A4和A1在奶牛源C.andersoni中分布廣泛，為優(yōu)勢亞型[16,19,26-30]，與本研究中A4、A4、A4和A1為優(yōu)勢亞型結(jié)果一致。但是在一些報道中也存在一定的差異，如：ZHAO等[29]發(fā)現(xiàn)陜西省奶牛源C.andersoniMLST優(yōu)勢亞型為A1、A4、A4和A1，而在國外，如美國常見亞型為：A2、A3、A2、A1，A2、A3、A1、A1和A2、A3、A4、A1；加拿大則常見亞型為：A2、A3、A4和A1；捷克共和國則常見亞型為：A2、A3、A4、A1和A1、A3、A4、A1[15]。國內(nèi)外C.andersoni亞型分布的不同也直接證明了中國奶牛源C.andersoni的流行并不是由于從國外引進奶牛所導(dǎo)致的。此外，與已報道C.andersoniMLST亞型相比較，本研究發(fā)現(xiàn)的MLST亞型A6、A4、A2和A1為新亞型。結(jié)果表明C.andersoni的遺傳特性差異可能與C.parvum和C.hominis一樣，存在地理隔離特征。

目前，C.andersoni卵囊形態(tài)鑒定僅限于蟲種的鑒定，并未涉及到不同亞型的對比研究。LINDSAY等[8]測定發(fā)現(xiàn)C.andersoniVS1742分離株卵囊大小為:(8.4±0.3) μm ×(6.2±0.2) μm(8.0～9.2 μm×5.8～6.4 μm，n=20)，卵囊指數(shù)為1.35(1.25～1.59)；C.andersoniKSU-3分離株卵囊大小為：(7.7±0.3) μm ×(5.9±0.3) μm(7.2～8.2 μm×5.6～6.4 μm，n=20)，卵囊指數(shù)為1.32(1.13～1.46)；C.andersoniVMTRC49分離株卵囊大小為：8.0 μm ×6.2 μm(7.4～8.8 μm×5.8～6.6 μm,n=20)，卵囊指數(shù)為1.28(1.19～1.40)。齊萌等[31]對河南地區(qū)不同C.andersoni分離株測定結(jié)果顯示，卵囊平均大小為：7.8 μm ×6.4 μm(5.3～8.1 μm×4.2～6.6 μm，n=100)，卵囊指數(shù)為1.22。在未來的研究中，不同地區(qū)、不同宿主、不同亞型的C.andersoni卵囊形態(tài)學(xué)鑒定仍將成為研究重點，以幫助對C.andersoni及其不同亞型卵囊進行準確鑒定。

本研究顯示鄭州地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染總體處于較低感染水平，但仍然具有人獸共患傳播風(fēng)險，應(yīng)引起養(yǎng)殖場和畜牧相關(guān)管理部門的重視，以降低公共衛(wèi)生安全威脅。此外，C.andersoni不同亞型的形態(tài)學(xué)和分子鑒定，為鄭州地區(qū)奶牛隱孢子蟲病的精準防控及人獸共患傳播風(fēng)險的準確評估提供數(shù)據(jù)支持。