香魚(Plecoglossus altivelis)脾臟酪氨酸激酶SYK 的鑒定及其介導(dǎo)的MAPK 信號(hào)通路研究*

孫 嬌 聶 力① 苗 亮 陳 炯，

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211； 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315832)

固有免疫是抵抗病原體入侵的第一道防線(Lemaitreet al， 1996)。宿主通過(guò)免疫反應(yīng)來(lái)阻止病原體的感染與復(fù)制， 并將病原徹底清除。這種反應(yīng)的前提是固有免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor， PRR)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecule patterns， PAMPs)， 發(fā)生受體配體反應(yīng)， 從而誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列相關(guān)的細(xì)胞因子來(lái)介導(dǎo)宿主的抗病原機(jī)制(Uematsuet al， 2006)。

酪氨酸激酶蛋白(protein tyrosine kinase， PTK)是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)， 它們能催化蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基使其發(fā)生磷酸化反應(yīng)， PTK 包括受體型和非受體型兩種(Huanget al， 2005)。脾臟酪氨酸激酶(SYK)是一種非受體型酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinase， NRTK)， 它與ZAP-70 關(guān)系最近， 同屬SYK 家族(Bolenet al， 1997)。來(lái)自細(xì)胞外的信號(hào)通過(guò)SYK 到達(dá)細(xì)胞質(zhì)從而介導(dǎo)一連串信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程(Bertonet al， 2005)。SYK 含有N 端的兩個(gè)SH2 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C 端激酶結(jié)構(gòu)域(Wong， 2005)。免疫受體信號(hào)需要SYK 的激酶活性以及兩個(gè)SH2 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行傳導(dǎo)。SYK 的激酶結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)的靜息狀態(tài)下是不活躍的， 但是可以通過(guò)將兩個(gè)SH2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合到雙磷酸化的ITAM 上而被激活(Mócsaiet al， 2010)。

研究表明， SYK 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中至關(guān)重要。在B 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中， SYK 被激活后進(jìn)一步激活鳥嘌呤核 苷 交 換 因 子(guanine nucleotide exchangefactor， GEF)， GEF 激活Ras 和Rac， 經(jīng)促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases， MAPK)途徑激活相關(guān)基因 (Buhlet al， 1997)。在T 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中， SYK 可與磷酸化ITAM 結(jié)合， 進(jìn)而啟動(dòng)下游pre-T 細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Palacioset al， 2007)。在Fc 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中， SYK 參與了FcεRI 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和分泌、細(xì)胞因子產(chǎn)生、脫粒等代謝過(guò)程(Zhanget al， 1996)。整合素是一個(gè)異二聚體跨膜受體家族， 參與白細(xì)胞粘附和遷移等， 在缺乏SYK 的中性粒細(xì)胞(Attilaet al， 2006)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(Vineset al， 2001)、血小板(Obergfellet al， 2002)和破骨細(xì)胞(Zouet al， 2008)中， 整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制。同時(shí)， SYK 還調(diào)控了病原體活化的先天免疫信號(hào)通路。在真菌識(shí)別方面， Dectin-1 與β-葡聚糖結(jié)合后促使SYK 活化， 隨后MAPK、NF-κβ 發(fā)生磷酸化被激活， 并促進(jìn)TNF-α、IL-6、IL-10 等炎癥細(xì)胞因子的分泌， 增強(qiáng)抗真菌免疫能力(Drummondet al， 2011)。除此之外， SYK 還可以識(shí)別組織損傷， 研究發(fā)現(xiàn)CLEC9A 與SYK 偶聯(lián)后能夠識(shí)別細(xì)胞損傷相關(guān)分子并介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Sanchoet al， 2009)。

相比于在哺乳動(dòng)物中較深透的研究， SYK 在硬骨魚中的功能研究相對(duì)較少較淺。雖然在石斑魚(Epinephelus coioides)(Moet al， 2016)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(Bianet al， 2018)等硬骨魚中有所報(bào)道， 但是研究均集中在對(duì)該蛋白的生物信息學(xué)分析、不同應(yīng)激條件下組織表達(dá)水平的研究， 而對(duì)其信號(hào)通路方面的研究， 特別是硬骨魚類SYK 是否也能像哺乳動(dòng)物一樣激活MAPK 信號(hào)通路的研究幾乎未有涉及。

香魚(Plecoglossus altivelis)是東亞地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)魚類(史雨紅等， 2017)。在香魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中， 由鰻弧菌(Vibrio anguillarum)引起的細(xì)菌性疾病是造成損失的主要原因(Luet al， 2016)?？紤]到SYK 在免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用， 研究香魚SYK(PaSYK)的結(jié)構(gòu)功能和活化的信號(hào)通路對(duì)后續(xù)的免疫防治至關(guān)重要。本研究分析了香魚SYK 基因的序列特征及其進(jìn)化地位； 研究了不同健康組織及鰻弧菌感染后免疫組織中PaSYK 基因mRNA 的表達(dá)變化； 采用激光共聚焦技術(shù)確定了PaSYK 的亞細(xì)胞定位； 除此之外， 研究了PaSYK 對(duì)MAPK 信號(hào)通路的活化作用及對(duì)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響， 從而分析其在進(jìn)化過(guò)程中功能的保守性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用香魚

本研究使用的香魚(Plecoglossus altivelis)購(gòu)自浙江省寧波市寧?？h某漁場(chǎng)， 選擇體重40—50g 的健康魚。實(shí)驗(yàn)前在20—22°C 的循環(huán)水系統(tǒng)中暫喂養(yǎng)兩周。所有實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法進(jìn)行， 并經(jīng)寧波大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 PaSYK 基因cDNA 序列測(cè)定及分析

提取香魚健康組織的RNA 并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。從香魚頭腎單核/巨噬細(xì)胞(Monocyte/macrophage， MO/MΦ)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得PaSYK 序列。使用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物(SYK F1/R1， 表1)， 以獲得的cDNA 為模板擴(kuò)增其開放閱讀框(ORF)， 然后進(jìn)行克隆和測(cè)序。PCR 反應(yīng)體系如下： cDNA 1μL， 上下游引物各1μL， dNTP (2.5mmol) 3.5μL， 10 × La Buffer 2.5μL， La Taq 0.25μL， ddH2O 15.75μL。PCR 程序如下： 預(yù)變性94°C 2min； 變性94°C 30s， 退火56°C 30s， 延伸72°C 2min， 30 個(gè)循環(huán)； 延伸72°C 10min。使用BioEdit 軟件將克隆的SYK 蛋白質(zhì)序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。使用ProtParam 在線分析其分子量和等電點(diǎn)。使用Clustal W 軟件對(duì)PaSYK進(jìn)行多重序列比對(duì)和同源性分析。使用 MEGA 6.0軟件以鄰接法(NJ)制作分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。本研究中使用的序列如表2 所示。

1.3 真核表達(dá)及熒光載體構(gòu)建

利用 Primer 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)真核表達(dá)引物(SYK F2/R2)及熒光載體引物(SYK F3/R3)， PCR 擴(kuò)增獲得相應(yīng)片段。將獲得的片段分別利用NotI/SfaA I以及EcoR I/BamH I 進(jìn)行雙酶切， 克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1-flag 及綠色熒光載體pEGFP-N1 上， 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒及熒光表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建的所有質(zhì)粒均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。使用EZNA?質(zhì)粒Midi 試劑盒(Omega Bio-Tek， 美國(guó))制備用于轉(zhuǎn)染的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。

表1 PCR 擴(kuò)增和RT-qPCR 所用引物及序列 Tab.1 Oligonucleotide primers used for PCR and RT-qPCR

表2 研究中所用到的SYK 蛋白序列信息 Tab.2 SYK protein sequences used in this study

續(xù)表

1.4 鰻弧菌感染與組織收集

鰻弧菌培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)(Zhanget al， 2018)。簡(jiǎn)述如下： 把鰻弧菌接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 28°C 恒溫?fù)u床過(guò)夜培養(yǎng)； 按照1︰100 的比例繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)， 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段收集菌體后用無(wú)菌的PBS 洗滌、計(jì)數(shù)， 并用PBS 將菌體稀釋至最適濃度。感染組的每只香魚腹腔注射 100μL 含有 1.2×104colony forming units (CFUs)鰻弧菌的PBS， 對(duì)照組的香魚注射等量的PBS。在感染后4、8、12、24 和48hpi (hours post infection)收集香魚的鰓、脾、頭腎、肝和腸進(jìn)行RNA提取。此外， 收集腸、脾、肝、鰓、頭腎和皮膚等健康組織提取RNA 并進(jìn)行組織表達(dá)分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

RT-qPCR 方法參考文獻(xiàn)(Chenet al， 2016)。簡(jiǎn)述如下： 香魚組織或細(xì)胞的總RNA 抽提采用RNAiso試劑(TaKaRa， 大連)， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 放在-20°C 冰箱備用。以上述cDNA 為模板， 采用SYBR 預(yù)混料Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa， 大連)利用ABI Stepone RT-qPCR 系 統(tǒng)(Applied Biosystems， 美 國(guó)) 進(jìn) 行RT-qPCR 反應(yīng)(引物見表1)。PCR 反應(yīng)條件如下： 95°C 30s， 60°C 20s， 72°C 30s， 共40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)； 隨后進(jìn)行熔解曲線94°C 30s， 72°C 30s， 94°C 30s。采取2-ΔΔCt的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)， 以Pa18S rRNA 作為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。

1.6 香魚頭腎單核/巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

收集健康香魚的頭腎， 洗滌和研磨后利用Ficoll (Invitrogen， 上海)密度梯度離心[(1.077±0.001)g/mL]獲得頭腎白細(xì)胞富集組分， 按照2×107/mL 的濃度將細(xì)胞接種到35mm 培養(yǎng)皿中(Corning， 美國(guó))， 在含5% CO2的培養(yǎng)箱中24°C 過(guò)夜培養(yǎng)。去除未貼壁細(xì)胞， 貼壁細(xì)胞在完全培養(yǎng)基[RPMI 1640 (Invitrogen， 上海)； 5% (V/V) FBS (Gibco， Life Technologies， 美國(guó))； 5% (V/V)香魚血清； 青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)]中繼續(xù)培養(yǎng)。HEK293T 細(xì)胞在含有10% (V/V) FBS、青霉素和鏈霉素的DMEM (Invitrogen， 上海)的培養(yǎng)基中， 在37°C 含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 瞬時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HEK293T 細(xì)胞和香魚頭腎 MO/MΦ 按照1×105/mL 的濃度接種到6 孔板(Corning， 美國(guó))中， 細(xì)胞融合到 70%—90%后使用 Lipofectamine 3000 (Invitrogen， 上海)轉(zhuǎn)染試劑將真核表達(dá)或綠色熒光載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中。

1.8 亞細(xì)胞定位

HEK293T 細(xì)胞接種在6 孔板中的圓形蓋玻片上。細(xì)胞培養(yǎng)12h 后， 轉(zhuǎn)染pEGFP-PaSYK 重組質(zhì)粒。連續(xù)培育36h， 用PBS 洗滌細(xì)胞兩次， 并在4% (V/V)多聚甲醛中固定15min。PBS 洗滌兩次， 用Dil (Beyotime， 中國(guó))染細(xì)胞膜10min， PBS 洗兩次， DAPI (Sigma， 美國(guó))染核5min。在激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710 NLO， Carl Zeiss， 美國(guó))下觀察細(xì)胞熒光圖像。

1.9 炎癥細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)測(cè)定

將pcDNA3.1-PaSYK 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至香魚頭腎MO/MΦ， 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag 空白質(zhì)粒作為對(duì)照。分別在24、36 和48hpt (hours post transfection)時(shí)收集細(xì)胞， RT-qPCR 檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β和IL-10 的mRNA 表達(dá)。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。

1.10 Western blot 分析

將pcDNA3.1-PaSYK 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞和香魚頭腎MO/MΦ 中， 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag 空白質(zhì)粒作為對(duì)照。在6、12、24 和48hpt 時(shí)收集細(xì)胞， 加入100μL 蛋白裂解液提取總蛋白， 使用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取15μL 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳， 并將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上(甲醇活化)； 將PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉(W/V)的TBST 中室溫封閉1h， 一抗孵育過(guò)夜。TBST 溶液洗膜3 次， 每次15min； 二 抗 采 用 山 羊 抗 兔 IgG-HRP， 室 溫 孵 育1.5h，TBST 溶液洗膜3 次， 每次15min。利用ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯色。用到的一抗為兔抗phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)、兔抗p38 MAPK、兔抗phospho-JNK1/2 (Thr183/Tyr185)、兔抗JNK1/2、兔抗phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)和兔抗P44/42 MAPK (ERK1/2)(Cell Signaling Technology， 上海)。

1.11 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)， 采用SPSS 13.0 軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， *P＜0.05 和**P＜0.01 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PaSYK 基因cDNA 序列測(cè)定及分析

PaSYK 的ORF 長(zhǎng)度為1857bp， 編碼的蛋白質(zhì)含有 618 個(gè)氨基酸。該蛋白質(zhì)的分子量(MW)為70.78kDa， 等電點(diǎn)(pI)為8.27。PaSYK 由兩個(gè)N 端的SH2 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C 末端的激酶結(jié)構(gòu)域組成。多重序列比對(duì)結(jié)果表明SYK 的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化過(guò)程中是高度保守的，PaSYK 與河鱒SYK 氨基酸序列相似度最高(82%)(圖1)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示， 所有魚類的SYK 歸為一簇， 哺乳類、兩棲類和 爬行類各為一簇，PaSYK 與河鱒的SYK 進(jìn)化關(guān)系最為密切(圖2)。

圖1 香魚SYK 氨基酸多序列比對(duì) Fig.1 Multiple alignment of PaSYK amino acid sequences

2.2 健康組織及鰻弧菌感染前后PaSYK 基因mRNA的表達(dá)分析

在健康香魚的腸、脾、肝、鰓、頭腎和皮膚中均檢測(cè)到PaSYK 的mRNA 表達(dá)，PaSYK 在皮膚中的表達(dá)量最高， 隨后依次為頭腎、鰓、肝、脾、腸(圖3a)。腹腔感染鰻弧菌后， 在所有檢測(cè)的組織中PaSYK 的mRNA 表達(dá)均以時(shí)間依賴性方式顯著上調(diào)。其中， 鰓組織中的PaSYK 表達(dá)量在4hpi 時(shí)上調(diào)， 24hpi 時(shí)表達(dá)最高。在脾臟中， 8hpi 時(shí)PaSYK 表達(dá)上調(diào)， 12hpi 時(shí)表達(dá)最高， 24hpi 時(shí)其表達(dá)下降并恢復(fù)至正常水平。在頭腎中， 8hpi 時(shí)PaSYK 表達(dá)上調(diào)， 并隨著感染的持續(xù)表達(dá)量逐漸增加。在肝臟中，PaSYK 表達(dá)在8hpi 時(shí)上調(diào)至最高， 然后逐漸降低至對(duì)照值水平。在24hpi 時(shí)， 腸中的PaSYK 表達(dá)上調(diào)最高(圖3b—f)。

2.3 PaSYK 亞細(xì)胞定位分析

HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光載體 pEGFP-PaSYK， 激光共聚焦顯微鏡下觀察PaSYK 的亞細(xì)胞定位(圖4)。結(jié)果顯示PaSYK 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中， 少量分布在細(xì)胞膜上， 與 DAPI(細(xì)胞核指示劑)無(wú)共定位信號(hào)。

圖2 基于NJ 法構(gòu)建的香魚和其他物種SYK 的系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig.2 Phylogenetic tree analysis of the SYK protein of ayu and other species using the neighbor-joining method

圖3 健康香魚組織和鰻弧菌感染后免疫組織中PaSYK 表達(dá)模式 Fig.3 The expression patterns of PaSYK in healthy ayu tissues and immune tissues after V. anguillarum infection

圖4 PaSYK 亞細(xì)胞定位 Fig.4 Subcellular localization of PaSYK

2.4 PaSYK 對(duì)炎癥細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)的影響

炎癥是機(jī)體受到病原體破壞或入侵時(shí)炎癥細(xì)胞被激活， 并分泌多種炎癥細(xì)胞因子的保護(hù)反應(yīng)。促炎因子TNF-α、IL-1β 以及抑炎因子TGF-β、IL-10 是巨噬細(xì)胞分泌的重要炎癥因子。研究TNF-α、IL-1β、TGF-β 和IL-10 的mRNA 表達(dá)水平， 旨在探討PaSYK對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示， 在香魚頭腎MO/MΦ 中，PaSYK 過(guò)表達(dá)后會(huì)顯著誘導(dǎo)TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)， 對(duì)抑炎因子的表達(dá)沒有起促進(jìn)作用甚至有略微的抑制(圖5a—d)。

圖5 PaSYK 影響炎癥細(xì)胞因子mRNA 表達(dá) Fig.5 The cytokine mRNA expression affected by PaSYK

2.5 PaSYK 活化MAPK 信號(hào)通路

我們進(jìn)一步研究了SYK 活化的信號(hào)通路是否在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性。MAPK 信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物SYK 激活的經(jīng)典信號(hào)通路。我們分別在HEK293T 細(xì)胞及香魚頭腎MO/MΦ 中轉(zhuǎn)染SYK 以研究三條典型的MAPK 信號(hào)通路p38 MAPK、ERK1/2 MAPK 和JNK1/2 MAPK 的活化情況。結(jié)果顯示， 在HEK293T細(xì)胞和香魚頭腎MO/MΦ 中過(guò)表達(dá)PaSYK 后均能檢測(cè)到三種MAP 激酶的磷酸化， 代表相應(yīng)的MAPK 信號(hào)通路被激活。在HEK293T 細(xì)胞中， 12hpt 時(shí)p38 的磷酸化水平上升， 在24hpt 時(shí)到達(dá)最大值， 隨后磷酸化水平降低(圖6a)。ERK1/2 的磷酸化在12hpt 達(dá)到最大值， 隨后逐漸降低(圖6b)。JNK1/2 的磷酸化水平也在12hpt 時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)， 在36hpt 達(dá)到最大值后降低(圖6c)。香魚頭腎MO/MΦ 在靜息狀態(tài)下能觀察到JNK1/2 磷酸化， 但在一個(gè)相對(duì)較低的水平(圖6f)。過(guò)表達(dá)PaSYK 后， p38 和ERK1/2 的磷酸化在12hpt 時(shí)升高， 24hpt 達(dá)到最大值， 隨后逐漸降低(圖6d—e)。JNK1/2 的磷酸化也在12hpt 時(shí)顯著升高， 24hpt 達(dá)到最大值， 隨后維持相似的活化程度(圖6f)。

3 討論

脾臟酪氨酸激酶SYK 在免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵的作用。本研究從分子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞水平對(duì)香魚SYK 進(jìn)行了分析， 結(jié)果表明香魚SYK 參與了鰻弧菌感染的免疫反應(yīng)， 并能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和激活MAPK 信號(hào)通路。

本研究通過(guò)香魚頭腎MO/MΦ 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得SYK 基因的cDNA 序列。多重序列比對(duì)分析表明，PaSYK 具有典型的SYK 結(jié)構(gòu)特征，PaSYK 包含兩個(gè)N 端的SH2 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端的激酶結(jié)構(gòu)域， 這與以往關(guān)于人(Lawet al， 1994)、七鰓鰻(Liuet al， 2015)、石斑魚(Moet al， 2016)、尼羅羅非魚(Bianet al， 2018)等其他物種的報(bào)道一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明， 哺乳動(dòng)物、鳥類、兩棲類和魚類的SYK 分別成簇，PaSYK 位于魚類SYK 這一個(gè)大簇， 且與河鱒SYK 進(jìn)化關(guān)系最近。

SYK 基因最開始是由Taniguchi 等(1991)從豬脾cDNA 中克隆出來(lái)。SYK 在人類的造血細(xì)胞中的表達(dá)量最高(Yanagiet al， 2001)。最初認(rèn)為SYK 只在造血細(xì)胞中表達(dá)， 后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)SYK 在乳腺上皮細(xì)胞(Coopmanet al， 2000)、氣道上皮細(xì)胞(Wanget al， 2005)、鼻成纖維細(xì)胞(Yamadaet al， 2001)、血管內(nèi)皮細(xì)胞(Crowleyet al， 1997)、神經(jīng)樣細(xì)胞(Tsujimuraet al， 2001)、肝細(xì)胞(Tsuchidaet al， 2000)及黑色素細(xì)胞(Hoelleret al， 2005)等非造血細(xì)胞中也有廣泛表達(dá)。 在七鰓鰻中， SYK 在神經(jīng)上髓樣體和白細(xì)胞中表達(dá)最高(Liuet al， 2015)。在石斑魚中， SYK 的mRNA 表達(dá)廣泛， 其中在肝臟和免疫器官(包括脾臟和腎臟)中高表達(dá)(Moet al， 2016)， 尼羅羅非魚與其結(jié)果相似(Bianet al， 2018)。本研究中，PaSYK 的mRNA 在皮膚中的表達(dá)量最高， 隨后依次為頭腎、鰓、肝、脾、腸。此外， 鰻弧菌感染后鰓、脾、頭腎、肝和腸免疫組織PaSYK 基因mRNA 表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。

圖6 PaSYK 激活MAPK 信號(hào) Fig.6 Activation of MAPK signaling by PaSYK

炎癥是一種病理過(guò)程， 病原體作用于機(jī)體后， 不僅會(huì)引發(fā)細(xì)胞的損壞， 也會(huì)使系統(tǒng)抗病能力提高， 從而到達(dá)清除病原體， 修復(fù)受損細(xì)胞的作用。在炎癥反應(yīng)中， 細(xì)胞能產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子來(lái)抵抗外界的侵襲， TNF-α、IL-1β、TGF-β 和IL-10 是巨噬細(xì)胞分泌的重要炎癥因子。本研究結(jié)果表明， 將SYK 基因轉(zhuǎn)染到香魚MO/MΦ 中， 促炎因子TNF-α 和IL-1β 的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)， 而抑炎因子TGF-β 和IL-10 的mRNA表達(dá)卻受到略微的抑制。PaSYK 能夠顯著誘導(dǎo)促炎因子TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)， 說(shuō)明機(jī)體受到病原體入侵時(shí)， SYK 能夠參與香魚頭腎MO/MΦ 的炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞對(duì)外界變化做出的反應(yīng)是通過(guò)一連串胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)傳導(dǎo)的， 信號(hào)通路整合各種信號(hào)， 通過(guò)基因和生理的改變來(lái)應(yīng)對(duì)外界刺激。MAPK 被激活后會(huì)參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡的調(diào)節(jié)， 并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)(Takadaet al， 2004)。Ras作為一種GTP 酶， 是MAPK 磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)分子。Ras-Raf-MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)是人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。有研究表明， 肥大細(xì)胞的FcεRI 受體與抗原結(jié)合后， 依賴SYK 銜接蛋白Shc磷酸化， 從而激活Ras-Raf-MAPK 級(jí)聯(lián)(Jabril-Cuenodet al， 1996)。為了探究香魚SYK 是否也能像哺乳動(dòng)物那樣激活MAPK 信號(hào)通路， 本研究將SYK 轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞和香魚頭腎MO/MΦ 中， Western blot的結(jié)果表示，PaSYK 過(guò)度表達(dá)后三種傳統(tǒng)的MAP 激酶均被激活， 說(shuō)明PaSYK 可以激活MAPK 信號(hào)， 其在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。

4 結(jié)論

本研究從香魚中克隆得到SYK 基因， 通過(guò)蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)， 在SYK 存在典型的兩個(gè)連接的SH2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域。通過(guò)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，PaSYK 的表達(dá)會(huì)受到鰻弧菌感染的影響。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，PaSYK 分布于細(xì)胞質(zhì)中， 細(xì)胞膜上也有少量的分布。RT-qPCR 結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，PaSYK 的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)促炎因子的表達(dá)并且抑制抑炎因子的表達(dá)。Western blot 結(jié)果證明，PaSYK 與其哺乳動(dòng)物中的同源物一樣， 能夠活化MAPK 信號(hào)通路， 說(shuō)明了其在進(jìn)化過(guò)程中， 結(jié)構(gòu)及功能的保守性。