多形微眼藻在不同氮源條件下固碳途徑 的轉(zhuǎn)錄組解析及與其他微藻的比對*

王甫文 李 迎 甄 毓 劉 乾

(1. 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室 青島 266100； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室 青島 266071； 3. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 青島 266100； 4. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003)

藻類通過生物碳泵調(diào)節(jié)大氣與海洋的CO2通量(鄧祥元等， 2015)， 其中硅藻每年可固碳 10 億噸(Robertset al， 2007)， 對海洋碳循環(huán)有重要意義。同時， 利用微藻固碳被認(rèn)為是一種環(huán)境友好性較高的碳捕集技術(shù)(鄧帥等， 2018)， 可以進(jìn)一步加工生產(chǎn)生物柴油、肥料和其他有用的產(chǎn)品(Pokoo-Aikinset al， 2010)， 被列為我國面向2020 年(郭烈錦等， 2011)、2050 年(夏茗， 2008)能源可持續(xù)發(fā)展的潛力研究方向之一。因此， 海洋微藻固碳途徑受到高度關(guān)注。

自然界中植物有三種固碳途徑， 分別是C3途徑(Calvin， 1962)、C4途徑和景天酸(CAM)途徑(盧笛， 2013； 劉乾等， 2016)， 其中C3途徑是光合碳同化的最基本途徑。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶(ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase)是C3途徑的起始限速酶(Haimovich-Dayanet al， 2013)， 由于其反應(yīng)底物CO2在海水表層的濃度遠(yuǎn)低于該酶半飽和常數(shù)(20—70μmoL/kg)(Badgeret al， 1998)， 海洋浮游植物Rubisco 酶的羧化反應(yīng)無法全速進(jìn)行， 進(jìn)而會限制浮游植物C3固碳過程。因此， 多數(shù)浮游植物為應(yīng)對低CO2環(huán)境(Beardallet al， 2002)， 在長期進(jìn)化中形成了無機碳濃縮機制(CO2concentrating mechanisms， CCMs)(Ravenet al， 2012)。該機制主要分為生物物理機制和生物化學(xué)機制， 生物物理機制主要通過碳酸酐酶(carbonic anhydrase， CA)催化碳酸氫根分解產(chǎn)生CO2， 提高Rubisco 酶周邊的無機碳濃度， 提高整個C3途徑固碳效率； 生物化學(xué)機制則是通過C4過程， 生成四碳化合物(草酰乙酸)并完成對CO2的富集。然而關(guān)于海洋微藻中是否存在C4途徑， 尚有較大爭議(Beardallet al， 1976； Reinfelderet al， 2000； Yoolet al， 2003； Onoderaet al， 2005)。Reinfelder 等(2000)發(fā)現(xiàn)威氏海鏈藻(T. weissflogii)可以通過一個類似C4的途徑濃縮胞內(nèi) CO2； Rech 等(2008)發(fā)現(xiàn)海氏藻(Haslea ostrearia)中存在C4代謝物； Armbrust 等(2004)發(fā)現(xiàn)假微型海鏈藻中具有PEPC 的編碼基因和PEPCK 的編碼基因。生物物理和生物化學(xué)機制都為C3過程的Rubisco 酶提供了更高的底物濃度， 從而加速了C3過程的固碳速度， 有效提高了微藻的固碳能力。

氮元素是支持浮游植物生長的重要營養(yǎng)鹽， 氮的同化代謝與碳代謝直接相關(guān)(Benderet al， 2014)。一方面， 當(dāng)環(huán)境中氮營養(yǎng)鹽缺乏限制硅藻生長時， 細(xì)胞中氮含量和蛋白質(zhì)水平下降， 碳氮比升高(Harrisonet al， 1990； La Rocheet al， 1993； Claquinet al， 2002)， 從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氮的再循環(huán)和胞內(nèi)富碳化合物的儲存(Allenet al， 2011； Palmucciet al， 2011； Hockinet al， 2012)， 并最終引起葉綠素的減少， 導(dǎo)致細(xì)胞衰亡(Kolberet al， 1988)， 光合作用能力降低， 進(jìn)而對碳固定和轉(zhuǎn)化能力產(chǎn)生負(fù)面影響(Behrenfeldet al， 2008)。另一方面， 氮代謝也需要ATP 和光合作用產(chǎn)生的還原劑(Falkowskiet al， 1975)， 以及TCA 循環(huán)產(chǎn)生的碳骨架(Turpin， 1991； Behrenfeldet al， 2008； Hockinet al， 2012)。因此， 探究不同氮營養(yǎng)條件下微藻的固碳過程對深入理解碳氮協(xié)同效應(yīng)與固碳途徑具有重要意義。

褐潮(brown tide)在美國及南非的部分河口暴發(fā)而引發(fā)生態(tài)災(zāi)害已有 20 余年的歷史(陳楊航等， 2015)。我國是第三個受褐潮侵?jǐn)_的國家(Zhanget al， 2012)， 2009 年至2015 年在秦皇島沿海水域發(fā)生的褐潮為當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖和旅游業(yè)帶來巨大損失(Zhenet al， 2016； Cuiet al， 2018)， 對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成了破壞性影響(Huanget al， 2020； Zhanget al， 2020)。一般認(rèn)為， 抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)是褐潮原因種。但隨著對秦皇島褐潮的深入研究， Qiao 等(2017)發(fā)現(xiàn)， 一種體型較小的硅藻——多形微眼藻(Minutocellus polymorphus)會與抑食金球藻相伴而生， 在 2013 年的秦皇島褐潮中， 最高密度可達(dá)5.92×104cells/L， 為褐潮第二大貢獻(xiàn)藻類。綜上， 本研究選擇不同氮源對多形微眼藻進(jìn)行條件培養(yǎng)， 以探究不同氮源對多形微眼藻固碳途徑的影響。分析結(jié)果一方面可豐富微藻的固碳通路研究， 另一方面也可為解釋多形微眼藻在群落中的競爭優(yōu)勢、厘清褐潮暴發(fā)原因提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)與建庫

多形微眼藻分離自秦皇島褐潮暴發(fā)期間， 保存于中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室藻種室。實驗前， 將多形微眼藻移入f/2 培養(yǎng)液中， 連續(xù)接種并達(dá)到指數(shù)生長中期3 次以上， 保證藻細(xì)胞維持較高的生理活性。為探究不同氮源對多形微眼藻固碳途徑的影響， 本文選取尿素和硝酸鈉兩種氮源進(jìn)行培養(yǎng)， 選取多形微眼藻在不同氮源下的最適生長濃度(對照組NaNO3， 882μmol/L； 實驗組CH4N2O， 氮的終濃度為400μmol/L)為培養(yǎng)條件(李迎等， 2019)， 培養(yǎng)基其他組分與f/2 培養(yǎng)基相同， 每組實驗做三組平行， 培養(yǎng)溫度(20±1)°C， 光暗比12h︰12h， 光照強度80—100μmol/(m2·s)。培養(yǎng)用海水取自青島近海(鹽度33， pH 范圍7.8—8.0)， 經(jīng)0.22μm 濾膜過濾， 120°C高壓滅菌20min。取實驗組和對照組的指數(shù)生長期樣品， 收集后送北京諾禾致源生物信息科技有限公司提取mRNA， 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR， 用AMPure XP beads純化PCR 產(chǎn)物， 得到最終的文庫， 庫檢合格后進(jìn)行Illumina HiSeqTM雙端測序。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

通過 CASAVA 堿基識別分析得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)， 以 FASTQ 文件格式存儲(Cocket al， 2010)。將這些序列信息進(jìn)行質(zhì)量評估， 得到可用序列(clean reads)， 用Trinity 對其進(jìn)行拼接(Grabherret al， 2011)， 將測序所得的序列拼接成轉(zhuǎn)錄本， 用 Corset程 序 進(jìn) 行 層 次 聚 類(Davidsonet al， 2014)， 得 到FASTA 格式文件。使用diamond v0.8.22 將最終結(jié)果與Nr、Swiss-Prot、KOG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(Buchfinket al， 2015)， 進(jìn)行核酸注釋、同源分析及蛋白質(zhì)注釋和預(yù)測； 使用NCBI blast 2.2.28+將得到的序列與Nt 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(Camachoet al， 2009)， 進(jìn)行核酸注釋和同源分析； 使用HMMER 3.0 package 比對PFAM與所得轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行蛋白質(zhì)工作注釋和預(yù)測(Finnet al， 2008)； 使用KAAS 服務(wù)器將所得結(jié)果與KO 及KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(Moriyaet al， 2007； Kanehisaet al， 2008)， 進(jìn)行通路富集分析； 使用 Blast2GO v2.5 將所得序列與GO 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(G?tzet al， 2008； Younget al， 2010)， 完成基因功能注釋。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果

對照組和實驗組經(jīng)無參基因組分析， 共得到58354 條序列。刪除低質(zhì)量測序序列后， 共得到43341條非重復(fù)序列基因。這些序列在GO、PFAM、Nr 數(shù)據(jù)庫中有較高比對率， 分別為 67.73%、67.02%、65.85%， 而在Nt、KO、SwissPort、KOG 數(shù)據(jù)庫中比對率較低， 均值約30% (表1)。在至少一個數(shù)據(jù)庫中有注釋的序列占83.31%， 而同時在所有數(shù)據(jù)庫中均有注釋的序列只有7.35%。

表1 轉(zhuǎn)錄組基因在各數(shù)據(jù)庫中注釋率統(tǒng)計 Tab.1 Annotation rates of RNA-seq sequences in databases

2.2 固碳途徑分析和基因表達(dá)情況

在光合生物碳固定途徑中， 受不同培養(yǎng)條件影響， 實驗組(氮源CH4N2O， 200μmol/L)和對照組(氮源NaNO3， 882μmol/L)在固碳通路中共注釋到164 個固碳相關(guān)編碼基因， 比對二者發(fā)現(xiàn)， 有33 個基因在實驗組出現(xiàn)明顯表達(dá)差異。

通過KEGG 通路富集分析， 分別構(gòu)建多形微眼藻的C3、C4固碳通路圖(圖1， 2)。在這兩種固碳途徑中， 只有C3途徑能夠獨立完成CO2的同化， C4固碳代謝途徑無法脫離C3途徑獨自存在， C4固碳途徑本質(zhì)上是通過對CO2的收集和濃縮完成植物的CO2再分配(Cerlinget al， 1993)， C4產(chǎn)生的CO2經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)的輸送， 進(jìn)入C3固碳過程完成最終固定過程。

圖1 多形微眼藻C3 固碳途徑通路圖 Fig.1 C3 carbon fixation pathway of Minutocellus polymorphus

圖2 多形微眼藻C4 固碳途徑通路圖 Fig.2 C4 carbon fixation pathway of Minutocellus polymorphus

如圖1 所示， 多形微眼藻中檢出羧化階段所必需的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基(ribulose- bisphosphate carboxylase large subunit， RBCL)編碼基因， 能夠進(jìn)行CO2固定。檢出還原階段所必需的磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase， PGK)編碼基因、NADP+-甘油醛-3-磷酸磷酸脫氫酶[glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase (NADP+)， GAPA]與3-磷酸 甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase， GAPD)兩種同工酶編碼基因， 有完成C3固碳途徑還原階段的分子基礎(chǔ)。在實驗組C3固碳途徑的還原階段中， GAPA 編碼基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)， 表示在有機氮源尿素中細(xì)胞可能降低了該過程的反應(yīng)速度， 減緩了C3固碳作用還原階段的發(fā)生。對于C3過程的再生階段， 重新生成核酮糖-1，5-二磷酸(ribulose- 1，5-diphosphate， Rubp)過程中的關(guān)鍵酶核酮糖磷酸激酶(phosphoribulokinase， PRK)編碼基因在尿素培養(yǎng)環(huán)境中發(fā)生顯著上調(diào)， 表示多形微眼藻在有機氮源中可能具有更快的固碳速率， 需要加快固碳底物Rubp 的生成為固定環(huán)境中的CO2提供底物。除此之外， 在C3過程的再生階段中， 轉(zhuǎn)羥乙醛酶(transketolase， TKT)編碼基因和丙糖磷酸異構(gòu)酶(triosephosphate isomer ase， TIM)編碼基因在尿素培養(yǎng)條件下都有顯著上調(diào)， 這同樣預(yù)示著多形微眼藻在有機氮源中可能有著提升Rubp 生成速度的機制。

如圖2 所示， 多形微眼藻具備完整的C4固碳過程相關(guān)編碼基因。含有羧化反應(yīng)階段所必需的PEPC編碼基因， 推測多形微眼藻能夠?qū)O2進(jìn)行固定， 生成草酰乙酸。在C4固碳過程的羧化階段中， PEPC 編碼基因在實驗組(氮源CH4N2O， 200μmol/L)中出現(xiàn)明顯下調(diào)， 表明通過C4固碳過程進(jìn)行固定CO2這一行為， 在有機氮源培養(yǎng)環(huán)境中可能有所下降。富集到還原和轉(zhuǎn)氨作用階段所必需的AAT 和蘋果酸脫氫酶 (malate dehydrogenase， MDH)編碼基因， 但未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)AAT 編碼基因， 推測在多形微眼藻內(nèi)可能存在草酰乙酸從細(xì)胞質(zhì)到葉綠體的自轉(zhuǎn)運途徑(D'Anielloet al， 2005)。在C4固碳過程還原和轉(zhuǎn)氨作用中， 葉綠體AAT 編碼基因發(fā)生顯著上調(diào)， 推測在有機氮環(huán)境中多形微眼藻轉(zhuǎn)化天冬氨酸生成草酰乙酸的速度加快。對于C4過程的脫羧反應(yīng)階段， 在多形微眼藻中發(fā)現(xiàn)了NADP-ME 型、NAD-ME 型和PCK 型脫羧反應(yīng)過程的基因表達(dá)。多形微眼藻在有機氮源里蘋果酸酶(NADP+dependent malic enzyme， MAO)編碼基因有顯著提高， 說明在實驗組環(huán)境中， NADP-ME 型脫羧反應(yīng)具備提高反應(yīng)速度的基礎(chǔ)； 本文發(fā)現(xiàn)， NAD-ME 型脫羧反應(yīng)過程的重要酶丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase， ALAT)編碼基因在有機氮環(huán)境中出現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)， 多形微眼藻在有機氮源中生長時通過 MA O 產(chǎn)生的丙酮酸可能主要是通過NAD-ME 型和PCK 型脫羧反應(yīng)過程發(fā)生； 對于PCK型脫羧反應(yīng)， 有機氮源培養(yǎng)的多形微眼藻PEPCK 編碼基因有顯著上調(diào)， 這意味著有機氮源培養(yǎng)的多形微眼藻， 具備提高PEPCK 將草酰乙酸轉(zhuǎn)化成磷酸烯醇式丙酮酸速度的基礎(chǔ)。在底物再生階段中， 在轉(zhuǎn)錄本中檢出了PPDK 編碼基因， 證明多形微眼藻中存在將丙酮酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸的編碼基因， 且在該過程中， 有機氮源培養(yǎng)的多形微眼藻PPDK 編碼基因表達(dá)有顯著上調(diào)， 推測多形微眼藻在有機氮源 中C4過程底物再生階段的速度加快。

2.3 多種微藻固碳途徑比較

為探究多形微眼藻固碳途徑規(guī)律及特點， 本研究選取兩種已經(jīng)測序完成的硅藻中心硅藻綱的假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)(Armbrustet al， 2004)和羽紋硅藻綱的三角褐脂藻(Phaeodactylum tricornutum)(Bowleret al， 2008)以及與多形微眼藻在同一海域暴發(fā)的抑食金球藻(Gobleret al， 2011)作為比對對象， 分析不同微藻固碳途徑的異同點。

2.3.1 多形微眼藻C3途徑對比 通過與三種目標(biāo)藻種的C3固碳途徑做比對， 我們發(fā)現(xiàn)在這幾類微藻中都具有完整的C3固碳途徑相關(guān)編碼基因表達(dá)。

圖3 四種微藻的C3 固碳途徑示意圖 Fig.3 Schematic diagram of the C3 carbon fixation pathway of four microalgae

從圖3 中可以看到， 作為固碳基本途徑， 幾種微藻的C3固碳途徑相關(guān)編碼基因都有完整表達(dá)。其中， 三角褐脂藻具有和多形微眼藻最相似的C3途徑編碼基因表達(dá)。除在三角褐脂藻中未發(fā)現(xiàn)GAPA 基因外， 二者C3固碳途徑在分子層面的表達(dá)基本一致。通過比對抑食金球藻和多形微眼藻C3固碳途徑編碼基因表達(dá)， 我們發(fā)現(xiàn)在抑食金球藻中沒有景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(sedoheptulose-1，7-bisphosphatase， SEBP)編 碼基因， 即抑食金球藻沒有完成景天庚酮糖-1，7-二磷酸到景天庚酮糖-7-磷酸轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)。通過比對假微型海鏈藻和多形微眼藻C3固碳途徑編碼基因表達(dá)， 我們發(fā)現(xiàn)在假微型海鏈藻中， 缺乏核酮糖-3-磷酸差向異構(gòu)酶(ribulose-phosphate 3-epimerase， RPE)編碼基因， 沒有完成核酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)運的基礎(chǔ)。在C3過程完整的四種藻中， 他們都具有相同的羧化、還原階段， 但在1，3-二磷酸甘油酸還原形成甘油醛-3-磷酸的過程中， 四種微藻分別通過同工酶 GAPA 或GAPD 編碼基因的表達(dá)， 提供1，3-二磷酸甘油酸還原的分子基礎(chǔ)。對于C3固碳途徑再生階段， 每種藻都具有核酮糖-1，5-二磷酸再生的必需酶核酮糖磷酸激酶 (phosphoribulokinase， PRK)編碼基因的表達(dá)。除不含有景天庚酮糖激酶(sedoheptulokinase， SHPK)編碼基因和(NAD(P))- 甘油醛-3- 磷酸磷酸脫氫酶{glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NAD(P))， GAP2}基因外， 多形微眼藻中具有光合生物中能檢出的C3固碳途徑底物再生過程全部相關(guān)酶基因。

2.3.2 多形微眼藻C4途徑對比 通過對比多形微眼藻、假微型海鏈藻(Armbrustet al， 2004)、三角褐脂藻(Bowleret al， 2008)和 抑 食 金 球 藻(Gobleret al， 2011)的C4固碳途徑， 本文發(fā)現(xiàn)在這幾類微藻中都具有C4固碳途徑相關(guān)編碼基因的表達(dá)， 暗示其可能通過PEPC 完成對大氣CO2的固定， 得到草酰乙酸， 并通過還原和不同的脫羧過程形成丙酮酸(NADP-ME型、NAD-ME 型脫羧)或磷酸烯醇式丙酮酸(PCK 型)， 隨后得到的丙酮酸經(jīng)PPDK 作用完成底物再生， 即生成固定CO2的底物磷酸烯醇式丙酮酸， PPDK 編碼基因在各微藻中均有富集。

圖4 四種微藻的C4 固碳途徑示意圖 Fig.4 Schematic diagram of the C4 carbon fixation pathway of four microalgae

由圖4 可知， 與多形微眼藻同時暴發(fā)的抑食金球藻具有與多形微眼藻更相似的C4固碳途徑。除在多形微眼藻中沒有檢測到細(xì)胞質(zhì)AAT 編碼基因外， 抑食金球藻擁有和多形微眼藻完全相同的C4固碳途徑相關(guān)編碼基因表達(dá)， 推測二者對固碳有相似的機制， 而多形微眼藻中缺乏的細(xì)胞質(zhì)AAT 編碼基因有可能是抑食金球藻更能適應(yīng)秦皇島海域生存環(huán)境， 并在秦皇島褐潮中成為優(yōu)勢種的原因。而通過對多形微眼藻和抑食金球藻的共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)， 分屬于硅藻門和金藻門的兩種微藻在生長過程中相互影響， 其對應(yīng)的初始密度和生長時期是決定競爭優(yōu)勢的主要因 素(Chenet al， 2018)。因此， 這也在一定程度上說明， 多形微眼藻和抑食金球藻可能占據(jù)相同的生態(tài)位置并具有相似的環(huán)境適應(yīng)能力， 而兩種微藻固碳途徑中C4基因的表達(dá)則為我們在轉(zhuǎn)錄水平上提供了有力證據(jù)。此外， 這兩種藻的C4固碳途徑相關(guān)編碼基因表達(dá)較其他兩種硅藻更加完整， 特別是抑食金球藻， 除缺少能在細(xì)胞質(zhì)中將草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸的MDH外， 具有光合生物中所能檢出的所有C4途徑相關(guān)編碼基因。與多形微眼藻和抑食金球藻相比， 假微型海鏈藻和三角褐脂藻的 C4固碳途徑只具有進(jìn)行NADP-ME 型脫羧過程的分子基礎(chǔ)。

2.4 多形微眼藻碳氮代謝協(xié)同效應(yīng)

實驗組多形微眼藻細(xì)胞在 C4固碳羧化階段的PEPC 編碼基因有顯著下調(diào)， 而在C4的還原階段、再生階段和 C3的再生階段相關(guān)固碳編碼基因如PEPCK、PPDK、PRK 等均有顯著上調(diào)， 這說明在有機氮源條件下， 由于C3途徑再生階段PRK、TKT 等編碼基因上調(diào)， 甘油醛-3-磷酸可能更多轉(zhuǎn)化為Rubp固碳底物而非淀粉， 因此多形微眼藻沒有發(fā)生胞內(nèi)富碳化合物儲存的分子基礎(chǔ)。同時， 在硝酸鹽利用方面， 實驗組細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)硝酸鹽同化的編碼基因((亞)硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因、(亞)硝酸鹽還原蛋白基因)表達(dá)顯著上調(diào)， 而高濃度的胞內(nèi)硝酸鹽含量常是誘導(dǎo)硝酸鹽還原酶高表達(dá)的因素(李迎等， 2019)， 因此推測實驗組多形微眼藻細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽含量有顯著提升； 在尿素利用方面， 實驗組氰酸鹽裂解酶基因顯著上調(diào)(李迎等， 2019)， 而氰酸鹽在細(xì)胞內(nèi)是氨甲磷酸和尿素的分解產(chǎn)生的， 因此推測實驗組細(xì)胞內(nèi)尿素的吸收同化量有顯著提升。從這兩方面看， 實驗組胞內(nèi)氮素含量水平有顯著提高， 而高水平的胞內(nèi)氮素含量將會有效規(guī)避氮缺乏引起的胞內(nèi)富碳化合物儲存(Allenet al， 2011； Palmucciet al， 2011； Hockinet al， 2012)， 這也從氮代謝的分子途徑為胞內(nèi)沒有發(fā)生富碳化合物儲存過程提供了佐證。此外， 在氮循環(huán)中檢出碳酸酐酶(carbonic anhydrase， CA)編碼基因(李迎等， 2019)， 該基因在氮的吸收利用中起催化氰酸鹽分解為氨的作用， 并為酶反應(yīng)過程提供CO2， 該酶也為固碳過程提供高濃度的CO2環(huán)境。

碳代謝同時也對氮代謝有重要作用， 氮代謝需要碳代謝產(chǎn)生的 ATP 和光合作用產(chǎn)生的還原劑(Falkowskiet al， 1975)， 以及TCA 循環(huán)產(chǎn)生的碳骨架(Turpin， 1991； Behrenfeldet al， 2008； Hockinet al， 2012)。在本研究多形微眼藻的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中， 實驗組氮代謝相關(guān)基因表達(dá)除谷氨酰胺合成酶下調(diào)外， 其余所有基因均表現(xiàn)上調(diào)或沒有顯著變化(李迎等， 2019)， 這可能意味著除銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為谷氨酸的過程外， 整體氮循環(huán)的加快， 這一過程對固碳過程提出了大量ATP、還原劑及碳骨架的需求， 故而實驗組多形微眼藻固碳途徑對實驗條件產(chǎn)生響應(yīng)， 提高了C3固碳過程的再生階段的相關(guān)酶編碼基因表達(dá)， 這意味著固碳所得到的有機物可能沒有轉(zhuǎn)化為淀粉積累到細(xì)胞中， 而是直接分解產(chǎn)生能量等代謝產(chǎn)物， 并以此為氮代謝途徑提供支持。

3 結(jié)語

通過分析多形微眼藻固碳途徑并與其他微藻固碳途徑進(jìn)行對比， 本文發(fā)現(xiàn)多形微眼藻同時具有完整的C3、C4固碳途徑的分子基礎(chǔ)， 與三角褐脂藻具有相似的C3固碳途徑編碼基因表達(dá)， 而與同時在秦皇島海區(qū)暴發(fā)的抑食金球藻具有相似的C4固碳途徑編碼基因表達(dá)。因此該藻能夠有效固定CO2， 有可能在環(huán)境中獲得競爭優(yōu)勢。通過分析多形微眼藻碳氮代謝途徑基因表達(dá)情況， 發(fā)現(xiàn)兩種代謝途徑可以相互支撐， 存在協(xié)同效應(yīng)。本研究為進(jìn)一步了解海洋浮游植物固碳途徑提供了基礎(chǔ)資料， 可為進(jìn)一步從蛋白質(zhì)組、代謝組等角度探索固碳過程提供方向。