G3BP1與乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥的相關(guān)性研究

董 翔，李晶晶，高 聰，王小磊，任鵬飛，王 弦，李煩繁

2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告(GLOBOCAN)顯示， 乳腺癌是女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率(46.3%)與死亡率(13.0%)均高居首位[1]。2013年的St Gallen共識(shí)將乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B型、HER-2擴(kuò)增型和三陰型等4種分子亞型[2]。Luminal型(Luminal A型和Luminal B型)為乳腺癌最常見(jiàn)的分子亞型，占總發(fā)病率的60%～70%[3]。內(nèi)分泌治療是該型乳腺癌患者的重要治療手段，藥物選擇包括雌激素受體調(diào)節(jié)劑他莫昔芬和芳香化酶抑制劑阿那曲唑、來(lái)曲唑等。但并不是所有的患者都能從中獲益，有20%～40%的乳腺癌患者在一線治療中即產(chǎn)生耐藥[4]。因此克服乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥是提高目前臨床治療效果的關(guān)鍵?，F(xiàn)有研究[5]顯示，多種關(guān)系到細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的信號(hào)通路激活與內(nèi)分泌耐藥有關(guān)，且與雌激素受體(estrogen receptor，ER)通路間存在串?dāng)_現(xiàn)象，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR，HER-2)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-IR)以及下游的MAPKs、PI3K/Akt/mTOR等。

G3BP1是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的RasGAP SH3結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合蛋白，由人類5號(hào)染色體上的g3bp1基因編碼[6], 參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)，在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[7]。近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)G3BP1與腫瘤細(xì)胞耐藥的相關(guān)性，先是有文獻(xiàn)[8]報(bào)道在乳腺癌細(xì)胞中，G3BP1高表達(dá)可引起阿霉素的化療耐藥。另有研究[9-10]表明，G3BP1在其他腫瘤細(xì)胞中涉及乳腺癌內(nèi)分泌耐藥通路。因此該研究通過(guò)基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析和臨床病理標(biāo)本檢測(cè)初步探討G3BP1在乳腺癌內(nèi)分泌耐藥中的作用，旨在探索與耐藥相關(guān)的分子機(jī)制及標(biāo)志物，為延緩甚至逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌治療耐藥提供可能的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)提取高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO) 隸屬美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的NCBI，于2000年創(chuàng)建，收錄了各國(guó)研究機(jī)構(gòu)提交的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，是現(xiàn)今最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源。以“G3BP1 and breast and endocrine therapy”在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中 (https://www．ncbi．nlm.nih.gov/geoprofiles)進(jìn)行檢索,納入G3BP1 mRNA在內(nèi)分泌治療藥物中的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 臨床資料收集2012年10月～2018年10月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科收治的、經(jīng)病理證實(shí)的Luminal型乳腺癌手術(shù)蠟塊標(biāo)本。根據(jù)以下要求入組：年齡>18歲；女性；原發(fā)單側(cè)乳腺癌；病理確診為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；非IV期患者；激素受體陽(yáng)性[ER和(或)PR陽(yáng)性，ER和PR陽(yáng)性定義為免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞在10%以上者]；HER-2陰性[HER-2(-)或(1+)者判定為陰性，(3+)者判定為陽(yáng)性，(2+)者原位熒光雜交法(FISH)再次檢測(cè)]；術(shù)后系統(tǒng)治療后輔助內(nèi)分泌治療(他莫昔芬或芳香化酶抑制劑)。Ki-6≥14%定義為高表達(dá)，<14%定義為低表達(dá)。

1.3 分子分型根據(jù)2013年St Gallen共識(shí)，將本研究中的Luminal乳腺癌患者進(jìn)一步分為3種分子亞型： Luminal A型：ER(+)和(或)PR(+)，HER-2(-)且低表達(dá)Ki-67；Luminal B，HER-2陰型：ER(+)和(或)PR(+)，HER-2(-)且高表達(dá) Ki-67；Luminal B，HER-2陽(yáng)型：ER(+)和(或)PR(+)且 HER-2(+)。由于既往研究證實(shí)HER-2可能與ER通路之間存在串?dāng)_機(jī)制，影響內(nèi)分泌治療耐藥[6]，因此在病例收集中排除Luminal B，HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者。

1.4 治療情況所有患者均接受規(guī)范化的局部(手術(shù)或放療)及系統(tǒng)治療(輔助化療和輔助內(nèi)分泌治療)。手術(shù)方式為乳腺癌改良根治術(shù)；輔助放療指征為原發(fā)腫瘤>5 cm、腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性數(shù)>4個(gè)或腋窩淋巴結(jié)清掃數(shù)<10個(gè)，但腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性數(shù)>20%、胸肌筋膜受侵及手術(shù)切口陽(yáng)性；輔助化療方案采用蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的化療，或紫杉類為基礎(chǔ)的化療，或蒽環(huán)類聯(lián)合紫杉類為基礎(chǔ)的化療；輔助內(nèi)分泌治療用藥為他莫昔芬或芳香化酶抑制劑。

1.5 分組情況第4版晚期乳腺癌國(guó)際指南共識(shí)將內(nèi)分泌治療耐藥細(xì)分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥。輔助內(nèi)分泌治療2年內(nèi)或晚期一線內(nèi)分泌治療不超過(guò)半年即出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展的視為原發(fā)性耐藥；輔助內(nèi)分泌治療超過(guò)2年或治療結(jié)束后1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，或者晚期一線內(nèi)分泌治療超過(guò)半年出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展的視為繼發(fā)性耐藥[11]。因此將所有患者分為原發(fā)耐藥組、繼發(fā)耐藥組、敏感組3組。原發(fā)耐藥組定義為輔助內(nèi)分泌治療時(shí)間<2年復(fù)發(fā)(局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移)；繼發(fā)耐藥組定義為輔助內(nèi)分泌治療時(shí)間>2年，未滿5年或5年療程結(jié)束后12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)(內(nèi)分泌治療標(biāo)準(zhǔn)療程為5年)；非上述情況者定義為敏感組。

1.6 隨訪隨訪時(shí)間以手術(shù)時(shí)間為起始時(shí)間，2019年4月1日為截止時(shí)間。所有患者采取住院或門診病歷隨訪，部分患者通過(guò)電話隨訪。隨訪內(nèi)容包括服藥情況、初次復(fù)發(fā)時(shí)間及復(fù)發(fā)部位。

1.7 主要試劑鼠抗人G3BP1單克隆抗體(sc-81940)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(PV-6000)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.8 免疫組化染色腫瘤蠟塊標(biāo)本均經(jīng)100 ml/L中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后做4 μm切片。制備好的切片于二甲苯溶劑中脫蠟并逐級(jí)梯度乙醇水化，30 ml/L雙氧水孵20 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸緩沖液中微波修復(fù)抗原，5%牛血清白蛋白封閉10 min后滴加G3BP1抗體，4 ℃過(guò)夜，二抗孵育30 min后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，藍(lán)化，梯度乙醇脫水，二甲苯2 min后中性樹膠封片。

1.9 結(jié)果判斷染色結(jié)果判定采用 Sinicrope 改良法[12]。在低倍鏡(×100 倍)下選取染色定位準(zhǔn)確、染色密度強(qiáng)的部位，在高倍鏡下(×400 倍)隨機(jī)選取5個(gè)視野， 每個(gè)視野數(shù)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞100個(gè)并計(jì)算染色細(xì)胞數(shù)，分5級(jí)，0分：染色細(xì)胞 <5%；1分：染色細(xì)胞5%～25%；2分：染色細(xì)胞25%～50%；3分：染色細(xì)胞50%～75%；4分：染色細(xì)胞>75%。染色強(qiáng)度分4級(jí)，0分：無(wú)色；1分：胞核或胞質(zhì)內(nèi)均勻分布淺黃色顆粒；2分：深棕黃色；3分：棕黑色，胞漿內(nèi)呈粗大顆?；驂K狀棕褐色。將染色細(xì)胞計(jì)數(shù)分?jǐn)?shù)×染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)，所得分?jǐn)?shù)<1分為(-)，2～3分為(+)，4～6分為()，≥7分為()，(-)和(+)判為低表達(dá)，()、()判為高表達(dá)。所有免疫組織化學(xué)切片由2名病理醫(yī)師分別閱片，結(jié)果一致者為最后判定。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提取結(jié)果GSE67916是在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載的經(jīng)4-羥基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)處理的乳腺癌MCF-7細(xì)胞數(shù)據(jù)集，包含10例他莫昔芬耐藥細(xì)胞株和8例他莫昔芬敏感細(xì)胞株，分析平臺(tái)為GPL570，G3BP1 mRNA在平臺(tái)中對(duì)應(yīng)的探針號(hào)為201514_s_at、244396_at和242422_at；GSE10911是經(jīng)阿那曲唑處理的MCF-7細(xì)胞數(shù)據(jù)集，包含3例阿那曲唑耐藥細(xì)胞株和3例阿那曲唑敏感細(xì)胞株，分析平臺(tái)為GPL571，G3BP1 mRNA在平臺(tái)中對(duì)應(yīng)的探針號(hào)為201503_at和201514_s_at。分析結(jié)果顯示：耐藥細(xì)胞株中的G3BP1 mRNA表達(dá)水平高于敏感細(xì)胞株(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 病例收集由于內(nèi)分泌治療患者絕大多數(shù)手術(shù)時(shí)間距今較長(zhǎng)，蠟塊收集難度大，最終僅收集原發(fā)腫瘤蠟塊標(biāo)本41例。其中接受他莫昔芬治療的32例(78.0%)，來(lái)曲唑治療的9例(22.0%)。17例在輔助內(nèi)分泌治療2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(41.5%)，提示為原發(fā)性耐藥；10例在內(nèi)分泌治療2年后，未滿5年出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(24.4%)，提示為繼發(fā)性耐藥；14例在完成5年內(nèi)分泌治療后12個(gè)月內(nèi)未出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(34.1%)，提示為內(nèi)分泌治療敏感。所有患者的臨床病理資料見(jiàn)表2。

表1 基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析他莫昔芬耐藥細(xì)胞株的G3BP1mRNA水平

2.3 G3BP1蛋白表達(dá)與內(nèi)分泌治療耐藥的關(guān)系G3BP1蛋白染色主要位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi) (圖1)。在內(nèi)分泌治療原發(fā)耐藥組中G3BP1高表達(dá)率為84.26%(圖1A)，繼發(fā)性耐藥組中為30.00%(圖1B)，敏感組中為28.60%(圖1C)，3組間G3BP1蛋白的高表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3，原發(fā)耐藥組中G3BP1蛋白的高表達(dá)率高于繼發(fā)耐藥組(84.62%vs30.00%，P<0.05)和敏感組(84.62%vs28.60%,P<0.05)，但繼發(fā)耐藥組的G3BP1表達(dá)情況與敏感組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(30.00%vs28.60%,P>0.05)。

圖1 G3BP1蛋白在三組中的高表達(dá)情況 IHC×200

3 討論

內(nèi)分泌治療是Luminal型乳腺癌最有效的治療方式，然而耐藥問(wèn)題無(wú)法避免。即使雌、孕激素受體均為陽(yáng)性，最終也僅有70%左右的患者初始治療有效，30%的患者存在內(nèi)分泌治療原發(fā)性耐藥，初治有效的患者在藥物維持一段時(shí)間后也相繼出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥。內(nèi)分泌治療耐藥已成為臨床上亟待解決的重要問(wèn)題。

表2 乳腺癌患者的臨床病理資料[n(%)]

表3 乳腺癌組織中G3BP1蛋白表達(dá)與內(nèi)分泌治療耐藥

本研究通過(guò)基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥細(xì)胞株中的G3BP1 mRNA表達(dá)水平高于敏感細(xì)胞株。PI3K/Akt/mTOR通路被證實(shí)是乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥的重要通路[13]，活化的PI3K/AKT及下游信號(hào)分子將ERα的Ser104、Ser106、Ser118和Ser167等氨基酸殘基磷酸化，引起ERα非激素依賴性激活，促使腫瘤細(xì)胞失去對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性而產(chǎn)生耐藥。有研究[10]顯示，下調(diào)G3BP1表達(dá)水平可以降低PI3K/AKT信號(hào)通路活性從而抑制食管癌細(xì)胞增殖，因此我們猜測(cè)G3BP1是否可能通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路參與乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥，這將有待于本課題組的進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究通過(guò)免疫組化染色結(jié)果顯示原發(fā)耐藥組中G3BP1蛋白的高表達(dá)率明顯高于繼發(fā)耐藥組和敏感組，提示G3BP1高表達(dá)容易引起原發(fā)內(nèi)分泌耐藥。目前ER表達(dá)缺失被認(rèn)為是原發(fā)性耐藥的主要機(jī)制，造成ER表達(dá)缺失的原因包括：Ras/Raf/MAPK通路過(guò)度活化；ER啟動(dòng)子CpG島異常甲基化、組蛋白去乙?；蝗毖醯萚14]。RasGAP是Ras蛋白的主要負(fù)性調(diào)節(jié)子,而G3BP1能與RasGAP SH3結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合調(diào)節(jié)RasGAP的活性進(jìn)而調(diào)控Ras信號(hào)通路[6]，猜測(cè)G3BP1可能通過(guò)調(diào)控Ras信號(hào)通路活性參與乳腺癌原發(fā)耐藥，這也將作為本課題組的下一步研究重點(diǎn)。繼發(fā)耐藥組與敏感組的G3BP1表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量收集較少有關(guān)，但從高表達(dá)率上仍可看出遞減趨勢(shì)。繼發(fā)性耐藥的精確生物學(xué)機(jī)制尚不清楚，考慮其基于某個(gè)特異性基因調(diào)控改變的可能性較小，而是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果[14]。

綜上所述，G3BP1與乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥密切相關(guān)，G3BP1有可能成為預(yù)測(cè)乳腺癌內(nèi)分泌耐藥和治療過(guò)程中的新靶點(diǎn)。本研究的不足之處在于收集的樣本數(shù)較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)驗(yàn)證假設(shè)；G3BP1與乳腺癌耐藥信號(hào)通路間的具體聯(lián)系尚不清楚，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)與研究。