微小RNA-22在食管癌患者血清中的表達與臨床意義

胡立華 張鑒穎 陳鵬

[摘要] 目的 探討微小RNA-22在食管癌患者血清中的異常表達及其臨床意義。 方法 45例食管癌患者血清標本均來自黑龍江省醫(yī)院2018年1月～2019年3月的門診及住院患者，均經(jīng)病理證實。采血前患者均未接受放射治療和化學藥物治療。45名健康對照者血清標本均來自健康體檢者。采用實時定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）法檢測食管癌患者和健康對照者血清中miRNA-22的表達水平。分析食管癌患者和健康對照者血清中的miRNA-22表達情況及食管癌患者血清miRNA-22表達水平與食管癌臨床病理特征之間的關系。 結果 86.67%（39/45）的食管癌患者血清中miRNA-22相對表達量明顯低于健康對照者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。T3、T4期患者血清中miRNA-22低表達率為93.3%（28/30），顯著高于T1、T2期患者的73.3%（11/15），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;且T分期越高，miRNA-22表達量越低，呈負相關關系（r=-0.523，P<0.05）;有淋巴結轉移者低表達率為96.0%（24/25），顯著高于無淋巴結轉移者的75.0%（15/20），差異有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而與患者的性別、年齡及腫瘤分化程度無明顯相關性（P>0.05）。 結論 miRNA-22在食管癌患者血清中的表達下調(diào)，且與食管癌的臨床病理特征密切相關。

[關鍵詞] 微小RNA-22;食管癌;血清;TNM分期

[中圖分類號] R73 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）24-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the abnormal expression of miRNA-22 in serum of patients with esophageal cancer and its clinical significance. Methods A total number of 45 serum samples were all collected from outpatients and inpatients with esophageal cancer who were treated in Heilongjiang Provincial Hospital from January 2018 to March 2019. All were confirmed by pathology. None of the patients were treated with radiotherapy and chemotherapy before blood collection. The serum samples of 45 healthy controls were all collected from healthy examinees. Real-time PCR（RT-PCR） method was used to detect the expression level of miRNA-22 in serum of patients with esophageal cancer and healthy controls. The expression of miRNA-22 in serum of patients with esophageal cancer and healthy controls， and the relationship between the expression level of serum miRNA-22 in patients with esophageal cancer and clinicopathological features of esophageal cancer were analyzed. Results The relative expression level of miRNA-22 in serums of 86.67%（39/45） of patients with esophageal cancer were significantly lower than those of healthy controls， with statistically significant differences（P<0.05）. The low expression rate of miRNA-22 in serum of patients with T3 and T4 esophageal cancer was significantly higher than that of patients with T1 and T2 esophageal cancer， which was 93.3%（28/30） and 73.3%（11/15）， respectively， with statistically significant difference（P<0.05）. A negative correlation was found as the higher the T stage， the lower the expression level of miRNA-22（r=-0.523， P<0.05）. The low expression rate of patients with lymph node metastasis was significantly higher than that of patients without lymph node metastasis， which was 96.0%（24/25） and 75.0%（15/20）， respectively， with statistically significant difference（P<0.05）. However， no significant correlations with gender， age and tumor differentiation of the patients were found（P>0.05）. Conclusion The expression of miRNA-22 in serum of patients with esophageal cancer is down-regulated and is closely related to the clinicopathological features of esophageal cancer.

[Key words] miRNA-22; Esophageal cancer; Serum; TNM staging

食管癌是常見的惡性腫瘤[1]。由于其早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，臨床上確診的食管癌患者多為中、晚期，5年生存率在10%左右。因此尋找敏感而特異的腫瘤標記物及早期診斷，對降低食管癌患者的病死率非常重要。近來研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（micro-RNA，miRNA）與腫瘤密切相關，是一種新的腫瘤標志物。miRNA不僅在腫瘤組織、細胞中異常表達，在腫瘤患者血清中也有特征性的表達譜，特定的血清miRNA表達譜對腫瘤的診斷、分類、治療以及預后均有重要的價值[2]。本研究通過檢測微小核糖核酸-22（micro-RNA-22，miRNA-22）在食管癌患者及健康對照者血清中的表達，為探討miRNA-22在食管癌中的生物學功能及與腫瘤的關系提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

45例食管癌患者血清標本均來自黑龍江省醫(yī)院2018年1月～2019年3月的門診及住院患者，其中男28例，女17例;年齡39～77歲，平均（58.6±3.1）歲。納入標準[3]：（1）胃鏡下活檢病理證實食管鱗狀細胞癌者;（2）采血前均未接受放療、化療、生物治療等任何治療者;（3）患者及其家屬知情并且積極配合參與本項目。排除標準[4]：（1）合并其他腫瘤者。（2）伴隨其他嚴重慢性疾病者。臨床分期按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第7版TNM標準分期：Ⅰ期/Ⅱ期15例，Ⅲ期/Ⅳ期30例;病理分級：高、中分化癌19例，低分化癌26例;有淋巴結轉移者25例，無淋巴結轉移者20例。45名健康對照者血清標本均來自健康體檢者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有標本均獲患者知情同意。

1.2 方法

用無菌注射器抽取食管癌患者及健康對照者靜脈血5 mL，常溫放置30 min，1500×g離心7 min，吸取上層血清轉入另一無菌離心管，800×g離心l0 min，取上清。待檢血清在-80℃保存?zhèn)溆?。按Trizol試劑盒說明書操作，提取血清總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度儀檢RNA溶液，測A260/A280比值，計算RNA濃度和純度，取A260/A280比值在1.8～2.1者用于進一步實驗檢測。取2 μg總RNA進行反轉錄，反應條件為：16℃ 30 min，42℃ 45 min，85℃ 5 min。實時定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）檢測miRNA-22，miRNA-22PCR擴增，上游引物：5'-AAGCTGCCA-GTTGAAGAACTGTA-3'，下游引物：5'-CTCGCTTC-GGCAGCACA-3'。反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。實驗反復3次，同時選取U6 snRNA為內(nèi)參照。U6內(nèi)參照上游引物：5'GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3'，下游引物：5'CGCTTC-ACGAATTTGCGTGTCAT3'。RT-PCR結果以Ct值表示，用2-ΔΔCt比較各樣品間miRNA-22的表達水平差異。

1.3 觀察指標

比較食管癌組與健康對照組血清miRNA-22的水平變化及食管癌組miRNA-22水平與臨床病理特征的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，Pearson法進行相關性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 食管癌患者及健康對照者血清中miRNA-22的表達

對45例食管癌患者和45名健康對照者血清標本中miRNA-22的表達進行檢測。結果表明：86.67%（39/45）的食管癌患者血清中miRNA-22相對表達量明顯低于健康對照者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=70.352，P<0.05）。

2.2 食管癌患者血清中miRNA-22的表達與臨床病理參數(shù)間的關系

以食管癌患者血清中miRNA-22表達量的中位數(shù)為分界點，將食管癌患者分為低表達組和高表達組[5]，分析各組與臨床病理參數(shù)之間的關系（表1）。結果表明：T3、T4期食管癌患者血清中miRNA-22低表達率為93.3%（28/30），顯著高于T1、T2期食管癌患者的73.3%（11/15），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=65.964，P<0.05）;且T分期越高，miRNA-22表達量越低，呈負相關關系（r=-0.523，P<0.05）;有淋巴結轉移者低表達率為96.0%（24/25），顯著高于無淋巴結轉移者的75.0%（15/20），差異有明顯統(tǒng)計學意義（χ2=66.233，P<0.05）;而miRNA-22的低表達率與患者的性別、年齡及腫瘤分化程度無明顯相關性（P>0.05）。見表1。

3 討論

Lee RC等[6]于1993年發(fā)現(xiàn)了一個22個堿基的小分子RNA-lin-4，其不能編碼蛋白質(zhì)，但卻能抑制蛋白質(zhì)翻譯，抑制蛋白質(zhì)合成。隨后科學家們發(fā)現(xiàn)了大量具有類似調(diào)控基因功能的小分子非編碼RNA，被稱為微小核糖核酸（microRNA，miRNA）。2004年Calin GA等[7]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞與正常細胞之間，miRNA表達譜明顯不同，約50%miRNA基因組定位于腫瘤相關的基因脆性位點上，多數(shù)可抑制腫瘤細胞的表達。既往研究表明：微小核糖核酸-22（micro-RNA-22，miRNA-22）在食管癌組織及細胞中的表達下調(diào)并與食管癌的臨床病理特征密切相關[8，9]。因為利用手術切除的標本進行分子生物學方面的檢測有一定的局限性，如標本來源的限制、無法連續(xù)檢測及隨訪等，所以腫瘤患者外周血中循環(huán)miRNA的檢測成為關注的熱點。2008年Lawrie CH等[10]發(fā)現(xiàn)在彌漫性B細胞淋巴瘤患者的血清中miRNA-21表達水平很高，并證實其與無復發(fā)存活率增高密切相關。miRNA-21成為第一個血清miRNA標志物，從此開啟了對血清中游離miRNA的研究。血清中游離miRNA的檢測具有損傷小、穩(wěn)定性良好、靈敏度高等優(yōu)點，可能成為新的腫瘤標記物。如能將其應用于臨床，可顯著提高腫瘤檢出率，促進腫瘤診斷學和治療學的進展。

miRNA在食管癌中的研究，主要集中在組織和細胞中。聶龍等[11]研究發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中miRNA-155的相對表達降低，可能抑制了機體抗癌作用，從而促進食管癌的發(fā)生與發(fā)展。蔣慶鋒等[12]研究指出食管癌組織中miRNA-802表達下調(diào)，并通過調(diào)控靶基因RAB23的表達參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。孟雪梅等[13]采用實時熒光定量PCR法檢測食管癌及其相應癌旁組織中miRNA -1299的表達水平，結果表明：miRNA-1299在食管癌組織中的表達水平明顯低于相應的癌旁組織且與食管癌患者的臨床分期具有相關性。符佳等[14]的研究顯示：miRNA-127-3p在食管鱗狀細胞癌組織及細胞中的表達均明顯低于癌旁正常組織及正常食管細胞。李彥樺等[15]采用qRT-PCR法證實在食管鱗癌組織中miRNA-320a低表達，而miRNA-181a-5p高表達，且其靶基因均為TGF-β1。目前，國內(nèi)一些學者已經(jīng)開始研究血清中游離miRNA的表達情況。謝子鈞等[4]研究表明食管癌患者血清中miRNA-10b的表達水平顯著低于健康體檢者。楊艷等[16]研究結果表明：食管癌患者血清中miRNA-451的表達水平明顯高于健康對照者，且miRNA-451的表達水平與食管癌患者的臨床分期和淋巴結轉移有關。而馬箐等[3]研究表明：在食管鱗癌患者血清中miRNA-320c高表達，但與腫瘤TNM分期及腫瘤病理分化程度無明顯相關性。

本研究通過實時定量PCR法檢測45例食管癌患者及45名健康對照者血清中miRNA-22的表達情況，并對患者臨床病理參數(shù)進行對比，結果表明：食管癌患者血清中miRNA-22相對表達量明顯低于健康對照者（χ2=70.352，P<0.05），這一結果與既往研究miRNA-22在食管癌組織及細胞中的表達下調(diào)相符[8，9]，提示miRNA-22在食管癌發(fā)生中具有抑癌基因的作用，血清miRNA-22可作為食管癌診斷的分子標志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清中miRNA-22低表達與患者淋巴結轉移和高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ）間具有明顯的相關性（P<0.05），且T分期越高，miRNA-22表達量越低，呈負相關關系（r=-0.523，P<0.05），提示miRNA-22的表達水平可以作為評價食管癌TNM分期和淋巴結轉移的一個輔助的評價指標，對患者預后評估有一定的參考價值。

研究表明，miRNA-22在胃癌組織中的表達下調(diào)，且其過表達可通過轉錄因子Sp1抑制腫瘤的浸潤和轉移[17]。miRNA-22在食管癌中的過表達是否可抑制其浸潤和轉移及其作用的機制需要進一步研究。另外，食管良性腫瘤、Barrett食管及食管腺癌患者血清中miRNA-22的表達水平及食管癌患者血清中miRNA-22的表達水平與放化療敏感性之間的關系亦有待下一步開展。

綜上所述，miRNA-22在食管癌患者血清中的低表達與食管癌的發(fā)生、浸潤和轉移密切相關，可能成為食管癌診斷及治療的新的分子生物學標志。

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（收稿日期：2020-06-03）