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    功能性多肽誘導(dǎo)羥基磷灰石仿生礦化的機制研究

    2020-10-13 00:44:44凌晨郭奕群
    關(guān)鍵詞:板狀沉淀物結(jié)合態(tài)

    凌晨,郭奕群

    (1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 科研與技術(shù)服務(wù)處,廣東 廣州 510300;2.華南理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州 510641)

    骨礦化是指無定形的磷酸鈣(Ca-P)發(fā)展成為結(jié)晶態(tài)的羥基磷灰石(Hydroxyapatite, HAP)結(jié)晶并埋于骨的有機質(zhì)間隙中的過程。無定形的Ca-P首先在由膠原纖維形成的三維基質(zhì)中的空穴區(qū)成核,隨后沿著膠原纖維向特定的方向生長,最終形成穩(wěn)定的板狀磷灰石晶體[1-2],如圖1所示。板狀磷灰石晶體占骨質(zhì)量的65%,是人體骨骼中的主要無機成分,它能促進缺損組織的修復(fù),顯示出生物活性,同時為骨提供優(yōu)異的機械學(xué)性能[3-4]。而溶液中的一些生物分子,如位于骨細胞外基質(zhì)中的富含酸性和磷酸化氨基酸基團的非膠原蛋白(Non-Collagenous Proteins, NCPs),會對HAP的成核和生長產(chǎn)生影響,在牙齒及骨骼的礦化過程中起著十分重要的作用[5-6]。研究表明,合成的HAP結(jié)合肽(HAP-Binding Apatites, HBPs),類似于NCPs對HAP表面也具有很高的親和力,且具有作為生物分子替代物的潛力,影響HAP的礦化[7-8],如圖2所示。因此,確定這些HBPs的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系顯得尤其必要,能夠給應(yīng)用于骨科和牙科治療的生物肽的設(shè)計提供新的啟發(fā)?;诖?,本研究選擇了三種合成肽鏈(VTK,VTK_7E和pVTK)作為模型HBPs,研究絲氨酸磷酸化、帶電氨基酸殘基、肽的凈電荷對蛋白質(zhì)二級構(gòu)象以及HAP成核與晶體生長過程的影響[9]。

    圖1 骨礦化示意圖[2]

    1 原材料與實驗方法

    本研究中所用到的化學(xué)試劑包括Ca10(PO4)6(OH)2(HAP,平均粒徑小于200 nm)、 CaCl2、(NH4)2HPO4、NaH2PO4·H2O、NaH2PO4、Na2HPO4與HEPES。溶液的溶劑均為超純水(ρ=18.2MΩ·cm),實驗前用NaOH溶液或鹽酸將溶液pH值調(diào)節(jié)至7.4。

    1.1 HBPs序列的設(shè)計

    VTK由Addison等人通過噬菌體展示技術(shù)確定[8]。肽中的酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸殘基翻譯后的磷酸化是蛋白質(zhì)或肽鏈參與調(diào)節(jié)骨礦化的重要過程[10]。由于VTK包含兩個具有磷酸化潛力的絲氨酸(S)殘基,因此通過VTK中兩個絲氨酸殘基的磷酸化獲得了另一個模型肽序列pVTK[8]。為了進一步建立肽電荷與其分子行為的關(guān)系,設(shè)計了一種突變的肽,即采用谷氨酸(E)殘基替代VTK的谷氨酰胺(Q)殘基,得到了凈中性電荷肽VTK_7E(見表1)。以上述三個HBP作為模型序列,探討HBP潛在的肽結(jié)構(gòu)對活性的影響。

    表1 HPBs的氨基酸序列以及凈電荷

    1.2 HBPs溶液態(tài)的制備及其二級結(jié)構(gòu)

    將各HBP分別溶于0.1 mM磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中,以獲得肽濃度為0.4 mM的溶液,以在后續(xù)測試中獲得高信噪比的圓二色光譜(Circular Dichroism, CD)。使用1 mm石英樣品池收集溶液,以0.1 nm的步長和0.5 nm·s-1的掃描速度在190~300 nm波長范圍內(nèi)進行CD光譜測試,并通過Dichroweb(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)分析從溶液到結(jié)合態(tài)的二級結(jié)構(gòu)變化百分比。

    1.3 HBPs結(jié)合態(tài)的制備及其二級結(jié)構(gòu)

    將30 mg·mL-1的HAP納米顆粒加入到500 μL濃度為0.4 mM的肽溶液中,置于室溫下孵育12 h,得到結(jié)合態(tài)HBPs。保持步長、掃描速度、波長范圍等參數(shù)與溶液態(tài)HBPs測試一致,對結(jié)合態(tài)HBPs進行CD光譜表征。

    1.4 Ca-P沉淀物的制備及其形態(tài)觀察

    為了確定Ca-P沉淀物的形態(tài)轉(zhuǎn)化,在0.1 mM HEPES緩沖液(pH=7.4)中制備25 mM的CaCl2溶液和15 mM的(NH4)2HPO4溶液,并在標(biāo)準(zhǔn)的96孔板上將(NH4)2HPO4溶液緩慢添加到CaCl2溶液進行反應(yīng)以獲得Ca-P沉淀物。隨后,將樣品置于二氧化碳培養(yǎng)箱中。為了表征不同時刻下Ca-P沉淀物的結(jié)構(gòu),分別在2 min,10 min,30 min,1 h, 4 h,和6 d時,從每個樣品中收集10 μL反應(yīng)溶液,滴在微柵上置于空氣中干燥1 d后用透射電子顯微鏡(簡稱TEM)進行分析,并對部分樣品使用選擇區(qū)域電子衍射(簡稱SAED)以獲得樣品的詳細晶體結(jié)構(gòu)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 HBPs在溶液態(tài)與結(jié)合態(tài)的二級結(jié)構(gòu)

    根據(jù)CD光譜分析HBPs在溶液中和結(jié)合態(tài)的相對二級結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果如表2。VTK在溶液中呈現(xiàn)41%的α螺旋結(jié)構(gòu)、17%的β折疊和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)及42%的無規(guī)卷曲,而當(dāng)VTK結(jié)合到HAP表面上時,其二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出67%的α螺旋結(jié)構(gòu)和33%的β折疊和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。這種從溶液態(tài)到結(jié)合態(tài)的構(gòu)象變化與VTK肽鏈中的帶電氨基酸基團與HAP表面離子(如Ca2+與PO4-)的結(jié)合有關(guān),如圖2所示。對于同時具有正負離子的VTK_7E,在溶液態(tài)時螺旋結(jié)構(gòu)含量高達91%,與HAP表面結(jié)合后,螺旋結(jié)構(gòu)含量降低至37%,而β結(jié)構(gòu)與無規(guī)卷曲則相應(yīng)增加。VTK和VTK_7E從溶液態(tài)到結(jié)合態(tài)的二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,表明了這些HBPs會發(fā)生二級結(jié)構(gòu)類型之間的轉(zhuǎn)變。相比之下,pVTK在溶液中主要表現(xiàn)為無規(guī)卷曲,并且在與HAP表面吸附后保持這種構(gòu)象,這可能是由于無規(guī)卷曲具有更好的靈活性,比有序的α、β結(jié)構(gòu)更易使帶電殘基與表面相互作用,可能更能影響HAP的結(jié)晶過程。

    圖2 HBPs與HAP表面結(jié)合示意圖

    表2 HPBs在溶液態(tài)和結(jié)合態(tài)的二級結(jié)構(gòu)特征

    2.2 HBP對于Ca-PO4 晶體成核與生長的調(diào)控作用

    2.2.1 對照組

    從TEM實驗結(jié)果得知,溶液中的Ca2+和PO4-在兩分鐘內(nèi)結(jié)合并形成直徑約為30~50 nm的球形納米顆粒,且這些球形納米顆粒相互連接形成隨機網(wǎng)絡(luò)(圖3a)。到10 min時,納米球逐漸聚集并形成了尺寸約為200~500 nm的顆粒(圖3b)。到30 min時,Ca-PO4晶體整體呈現(xiàn)出明顯的針狀聚集結(jié)構(gòu),還有少部分板狀結(jié)構(gòu)和極少的納米球(圖3c),與Ca-PO4晶體從無定形納米球到結(jié)晶Ca-P的理論相變過程相吻合。1 h后,納米球完全消失,主要結(jié)構(gòu)特征為針狀結(jié)構(gòu),并且表現(xiàn)出了更大程度的聚集(圖3d)。通過對SAED結(jié)果的分析可以確定HAP晶體的(002)、(211)和(004)面,從而確認(rèn)晶體Ca-P相為HAP(圖4a)。納米球的消失表明大多數(shù)或所有無定形相已轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)晶HAP。從4 h到6 d,針狀聚集體持續(xù)生長,并出現(xiàn)了一些六角形板狀結(jié)構(gòu)(圖3e-f)。

    圖3 對照組中Ca-P沉淀物的形態(tài)變化

    圖4 Ca-P反應(yīng)1h時的SAED衍射圖。

    2.2.2 實驗組

    在VTK,VTK_7E和pVTK存在的情況下,在前兩分鐘內(nèi)的Ca-P沉淀物中也觀察到的球形納米顆粒(圖5a、圖6和圖7)。但相比對照組而言,這些納米球的平均尺寸更大,但數(shù)量較少,且沒有形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由此可以推測HBP的存在抑制了Ca-PO4晶體成核位點的形成。10 min時,所有肽系統(tǒng)中均形成了較大的球形顆粒聚集體(圖5b,6b和7b)。 30 min時,在VTK存在下形成的Ca-PO4沉淀物主要表現(xiàn)為針狀結(jié)構(gòu)、少部分板狀結(jié)構(gòu)和極少的納米球(圖5c),該形態(tài)結(jié)構(gòu)與對照組相似,但相比而言針狀結(jié)構(gòu)的聚集體的尺寸更小。當(dāng)VTK_7E存在時,反應(yīng)到30 min后就已經(jīng)觀察不到球形納米顆粒(圖6c),此時Ca-P的形態(tài)主要為針狀以及板狀結(jié)構(gòu)。然而,在pVTK存在的情況下,同一時刻下Ca-PO4沉淀形態(tài)結(jié)構(gòu)仍然為無定形顆粒(圖7c)。該結(jié)果表明,pVTK對于相變的抑制作用更顯著。從30 min到1 h,在VTK存在下形成的沉淀已經(jīng)完全相轉(zhuǎn)化為結(jié)晶形式(圖5d);而在VTK_7E存在的情況下,沉淀物的形態(tài)特征無明顯變化(圖6d);在pVTK存在的情況下,無定形顆粒仍在存在(圖7d)。這表明pVTK對Ca-P晶體相變過程具有持續(xù)抑制作用。根據(jù)SAED圖像的衍射環(huán),確定1 h 時VTK和VTK_7E系統(tǒng)HAP的(002)和(211)面(圖4b和圖4c),證實了溶液中逐漸形成了結(jié)晶型HAP。 但是,在存在VTK的情況下,沉淀物的衍射環(huán)更為擴散,意味著Ca-P結(jié)晶度較小。pVTK樣品未出現(xiàn)衍射環(huán),表明系統(tǒng)中缺乏結(jié)晶型HAP(圖4d),與TEM直接觀測結(jié)果相吻合。隨反應(yīng)時間的增長,VTK和VTK_7E樣品中Ca-P形態(tài)上沒有顯著差異(圖5e和6e),但在pVTK系統(tǒng)中首次觀察到了針狀和薄帶狀結(jié)構(gòu),證實了相轉(zhuǎn)變過程的發(fā)生。在4 h~6 d之間,VTK,VTK_7E和pVTK系統(tǒng)中的主要析出物形態(tài)逐漸發(fā)展為小平板狀晶體,直至實驗周期結(jié)束(圖5f,6f和7f)。

    圖5 VTK實驗組中Ca-P沉淀物的形態(tài)變化

    圖6 VTK_7E實驗組中Ca-P沉淀物的形態(tài)變化

    圖7 pVTK實驗組中Ca-P沉淀物的形態(tài)變化

    3 結(jié)論

    本研究通過調(diào)控HAP成核和生長過程,研究了HBPs特征對其活性的影響。HBPs能抑制Ca-PO4的成核作用,并抑制其向結(jié)晶HAP的相轉(zhuǎn)變過程。HBPs通過吸附在特定晶面調(diào)節(jié)晶體生長方向,最終誘導(dǎo)HAP晶體形成板狀結(jié)構(gòu)。此外,磷酸化且凈電荷高的pVTK對HAP的成核與生長的影響更為顯著,說明磷酸化的肽鏈更能影響HAP的結(jié)晶過程。本文結(jié)果表明HBPs類似于生物體內(nèi)的NCPs,具有調(diào)控生物HAP板狀晶體成核和生長過程的作用,HBP構(gòu)效關(guān)系的揭示也有助于更深入地探討生物礦化機理。

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