霉變培養(yǎng)對果蠅眼色突變的影響*

歐陽雪艷 華樹海

（廣東省湛江市第二中學(xué) 廣東湛江 524022）

霉菌污染給人類的生產(chǎn)和生活帶來很多危害，食物霉變會(huì)導(dǎo)致外觀潰爛變形、產(chǎn)生腐敗氣味和黏液污穢物等，不僅降低食品的營養(yǎng)價(jià)值，而且還可能產(chǎn)生各種有毒有害物質(zhì)，引起食用者急性中毒或慢性毒害。食物發(fā)霉后，二級(jí)胺、亞硝酸鹽等含量會(huì)提高，為亞硝胺的合成提供了物質(zhì)條件。有研究表明，大鼠食用霉變食物后，在胃內(nèi)合成了亞硝胺，且在胃內(nèi)停留時(shí)間越長，合成的亞硝胺就越多。同時(shí)不排除有其他致癌物（例如霉菌毒素）的形成。霉變產(chǎn)生的毒素可能導(dǎo)致動(dòng)物生長受阻、繁殖機(jī)能下降、組織壞死、免疫抑制、致癌及基因突變等［1］。本文通過研究霉變培養(yǎng)對果蠅眼色的影響，以探索霉變對動(dòng)物生長發(fā)育的毒性。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1）通過每一代果蠅雌雄間交配，并重復(fù)多代以減少個(gè)體間的基因差異，得到同性別個(gè)體基因較一致的種系果蠅。

2）果蠅眼睛顏色的表現(xiàn)是由于大約80 多個(gè)基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)和相互作用，這些基因的作用包括參與眼色素前體物的運(yùn)輸、色素顆粒的合成、色素顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)和色素顆粒的沉積［2］。

3）霉變毒素影響果蠅眼色的表現(xiàn)過程。

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 實(shí)驗(yàn)材料和用具

實(shí)驗(yàn)材料：野生型黑腹果蠅。

實(shí)驗(yàn)器具和藥品：數(shù)碼顯微鏡、保溫箱、電磁爐、高壓滅菌鍋、電子天平、培養(yǎng)瓶（錐形瓶）、量筒、白紙若干、紗布、小塑料條、藥棉、酵母粉、記號(hào)筆、膠圈、棉線、玉米粉、瓊脂、白糖、丙酸等。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

2.2.1 培養(yǎng)基配方 玉米粉10 g、瓊脂粉1.5 g、酵母粉0.7 g、丙酸0.5 mL、水76 mL、白糖13.5 g。

2.2.2 培養(yǎng)基的配制

1）果蠅正常培養(yǎng)基的配制。在38 mL 水中加入瓊脂粉和白糖，煮沸使其充分溶解（期間不斷攪拌，防止糊底）。另取38 mL 水加入玉米粉攪勻，緩慢倒入上述瓊脂溶液中，繼續(xù)攪拌成糊狀煮沸。待培養(yǎng)基冷卻至70℃后加入0.5 mL 丙酸攪拌均勻，趁熱將培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)瓶中約2 cm 厚，加蓋紗布棉塞后冷卻待用。培養(yǎng)瓶與紗布棉塞等應(yīng)提前高壓滅菌［3］。接種果蠅前，再加入酵母粉和已消毒的小塑料條。

注意事項(xiàng)：①培養(yǎng)基分裝時(shí)需要注意的問題比較多，否則容易受到污染。最好在無菌室或超凈工作臺(tái)上分裝培養(yǎng)基，倒培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意不要沾到瓶口及瓶壁。②分裝好培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶及時(shí)蓋上紗布棉塞，冷卻放置1～2 d，待培養(yǎng)瓶上的水汽蒸發(fā)干。③不能過早將酵母粉加入培養(yǎng)基中，否則容易失活影響果蠅食用。

2）果蠅霉變培養(yǎng)基的配制。按上述配方配制培養(yǎng)基，不添加丙酸，不需要無菌操作。冷卻后用單層紗布封口，在室內(nèi)分別放置6 d、12 d、24 d、30 d，使培養(yǎng)基發(fā)生不同程度的霉變。

2.2.3 對野生型果蠅的培養(yǎng)至第5 代 將野生型果蠅轉(zhuǎn)移至果蠅正常培養(yǎng)基中，斜放3 cm×10 cm的粗糙面的塑料條，在適宜溫度（約25℃）下進(jìn)行培養(yǎng)。每星期更換一次培養(yǎng)基，對每一代的果蠅子代與親代進(jìn)行分離，直至第5 代幼蟲。

2.2.4 霉變培養(yǎng)基中培養(yǎng)第6 代果蠅 將第5代果蠅幼蟲均分為2 個(gè)重復(fù)組，每個(gè)重復(fù)組隨機(jī)均分為4 組，分別轉(zhuǎn)移至不同發(fā)霉程度的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察果蠅生活狀態(tài)和生活力。待其交配并產(chǎn)生第6 代果蠅幼蟲后，將第5 代果蠅成蟲轉(zhuǎn)移出培養(yǎng)基，并繼續(xù)在各霉變培養(yǎng)基中培養(yǎng)第6 代果蠅至成蟲。

2.2.5 第6 代果蠅成蟲的麻醉 在麻醉瓶的棉塞上滴加少量乙醚，然后迅速拔去裝有果蠅培養(yǎng)瓶的棉塞。使培養(yǎng)瓶和麻醉瓶口相對，并拍打培養(yǎng)瓶使果蠅全都進(jìn)入麻醉瓶，然后迅速將麻醉瓶塞上棉塞。麻醉后將果蠅倒在白磁板上。當(dāng)果蠅翅膀上翹45°時(shí)，表示已死亡，不可再用［4］。

2.2.6 觀察果蠅第6 代的性狀 使用數(shù)碼顯微鏡，調(diào)至側(cè)面光源，將昏迷的果蠅置于載玻片上，不加蓋玻片，即可清晰觀察到果蠅各結(jié)構(gòu)特征。甚至能觀察到昏迷果蠅的腹部運(yùn)動(dòng)，還可拍攝完整、清晰的圖片，便于結(jié)果的記錄、對比和分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 果蠅主要性狀觀察 觀察經(jīng)乙醚麻醉后果蠅的外部形態(tài)，包括口器、觸角、眼色、體色、翅形和剛毛等（圖1～圖3）。并從體形大小、腹背部條紋數(shù)、尾部圓銳和復(fù)雜程度、性梳的有無等特征鑒別果蠅的性別。性梳是一種梳狀的黑色鬃毛狀結(jié)構(gòu)，位于雄果蠅前足第一附節(jié)前端的指狀突起處。雌果蠅無性梳，這是果蠅雌、雄鑒別的重要依據(jù)［5］。

圖1 果蠅前足剛毛

圖2 果蠅口器

圖3 果蠅腹部條紋

3.2 霉變培養(yǎng)對果蠅眼色的影響

3.2.1 圖片比較（圖4～圖6）

圖4 野生型和亮紅眼果蠅（圓圈標(biāo)注）

圖5 紅眼（野生型）

圖6 亮紅眼（突變型）

3.2.2 數(shù)據(jù)記錄（表1、表2）

表1 不同程度發(fā)霉培養(yǎng)基中第6 代果蠅野生型和突變體的數(shù)量統(tǒng)計(jì)（重復(fù)組1）

表2 不同程度發(fā)霉培養(yǎng)基中第6 代果蠅野生型和突變體的數(shù)量統(tǒng)計(jì)（重復(fù)組2）

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

結(jié)果表明，霉變培養(yǎng)的2 個(gè)重復(fù)組中均有果蠅個(gè)體突變，且隨著霉變程度的增大，果蠅眼色變異率有增大趨勢。

5 實(shí)驗(yàn)過程中所遇到的問題及解決方案

5.1 實(shí)驗(yàn)溫度不適宜 果蠅培養(yǎng)的適宜溫度為23～25℃。培養(yǎng)溫度高于30℃時(shí)，會(huì)導(dǎo)致果蠅不育甚至死亡。培養(yǎng)溫度過低，果蠅生活周期會(huì)延長，生育力和生活力會(huì)下降。因此，可根據(jù)實(shí)際情況，將果蠅培養(yǎng)瓶置于適宜溫度的保溫箱中，定時(shí)觀察果蠅生活力及狀態(tài)。

5.2 培養(yǎng)基過濕或過干 實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基過濕或過干的現(xiàn)象。過早地將酵母粉加入培養(yǎng)基，容易使培養(yǎng)基提前發(fā)酵，導(dǎo)致培養(yǎng)基濕度過大，粘住果蠅翅膀致其死亡，影響果蠅接種。培養(yǎng)基因失水而干結(jié)成塊，與瓶壁分離，不僅不利于果蠅產(chǎn)卵，且容易造成果蠅掉入縫隙致死。因此，培養(yǎng)過程中要視培養(yǎng)基情況及時(shí)轉(zhuǎn)接果蠅，酵母粉的選擇與添加時(shí)間也影響培養(yǎng)基的干濕，要謹(jǐn)慎挑選酵母粉并在轉(zhuǎn)移果蠅前加入培養(yǎng)基；為防止果蠅溺水可在培養(yǎng)瓶中斜放已消毒的3 cm×10 cm粗糙面塑料條（改變使用紙條的做法，紙條易吸水皺縮和發(fā)霉），為果蠅提供活動(dòng)場所。

5.3 果蠅子代的轉(zhuǎn)移 果蠅產(chǎn)卵一段時(shí)間后，卵將進(jìn)入幼蟲階段，幼蟲身體呈乳白色，較柔軟，此時(shí)需要對幼蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)移，以防培養(yǎng)基較長時(shí)間不更換而發(fā)霉，影響果蠅幼蟲的生長和發(fā)育。一旦果蠅幼蟲結(jié)繭便會(huì)粘附在培養(yǎng)瓶壁上，強(qiáng)行取下進(jìn)行轉(zhuǎn)移會(huì)造成部分果蠅繭破裂而死亡，降低了果蠅子代的成活率。綜上，必須在果蠅幼蟲發(fā)育成繭之前對果蠅幼蟲進(jìn)行培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移。由于果蠅幼蟲較柔軟，可使用棉簽刮下培養(yǎng)瓶壁上的果蠅幼蟲，注意動(dòng)作要輕緩，以免對果蠅幼蟲造成傷害。

5.4 更換培養(yǎng)基時(shí)果蠅成蟲的轉(zhuǎn)移 更換培養(yǎng)基時(shí)果蠅成蟲的轉(zhuǎn)移較困難，既要防止果蠅飛出造成不同組混雜，又要避免對果蠅成蟲造成傷害，降低成活率?？墒褂靡严镜陌准垼沓陕┒窢?，上部與原培養(yǎng)瓶口緊密相連，下部留出足夠果蠅進(jìn)入的小孔并與新培養(yǎng)瓶口相連。既可保證進(jìn)入培養(yǎng)基的果蠅是活動(dòng)力較強(qiáng)的果蠅，又可防止其他污染物進(jìn)入培養(yǎng)基。培養(yǎng)瓶下墊海綿，轉(zhuǎn)移過程中將培養(yǎng)瓶不停地敲打墊有海綿的桌面，使果蠅通過漏斗型的紙筒小孔掉入培養(yǎng)基中。

6 研究創(chuàng)新點(diǎn)

6.1 材料創(chuàng)新 為了研究霉變對動(dòng)物生長發(fā)育的影響，本實(shí)驗(yàn)使用生長周期短、繁殖速度快、相對性狀明顯的果蠅作為實(shí)驗(yàn)材料。果蠅作為模式生物在初、高中實(shí)驗(yàn)中卻較少被使用，本實(shí)驗(yàn)為初、高中生物學(xué)教學(xué)中圍繞果蠅開展實(shí)驗(yàn)提供了可行途徑。

6.2 方法創(chuàng)新

1）改變傳統(tǒng)使用體視鏡觀察果蠅的方法，采用數(shù)碼顯微鏡觀察，使用側(cè)面光源，清晰地觀察到放大倍數(shù)較高的果蠅結(jié)構(gòu)特征，并可拍攝觀察與分析。

2）在轉(zhuǎn)移果蠅成蟲時(shí)，使用自制紙漏斗對其進(jìn)行轉(zhuǎn)移。培養(yǎng)瓶下墊些海綿，轉(zhuǎn)移過程中將培養(yǎng)瓶不停地敲打墊有海綿的桌面，使果蠅通過紙漏斗的小孔掉入培養(yǎng)基中。

3）為防止果蠅溺亡可在培養(yǎng)基中斜放已消毒過的3 cm×10 cm 的粗糙面的小塑料條，為果蠅提供活動(dòng)場所。

6.3 目的創(chuàng)新 經(jīng)查證，已有的研究主要集中在酒精、甲醛等物質(zhì)對果蠅生長發(fā)育和繁殖力各方面的影響，很多實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)果蠅過程中避免培養(yǎng)基霉變，但少有實(shí)驗(yàn)課題在霉變是否影響果蠅的生長發(fā)育方面做研究。本實(shí)驗(yàn)從果蠅生長環(huán)境中最常見的霉變出發(fā)，通過將基因型基本相同的果蠅放置于不同發(fā)霉程度的培養(yǎng)基中，觀察霉變的培養(yǎng)基是否對果蠅眼色變異有影響，開創(chuàng)了新的實(shí)驗(yàn)思路和方向。

果蠅眼色的控制因生化機(jī)制包括許多環(huán)節(jié)而存在多基因一效現(xiàn)象。研究表明，亮紅眼果蠅眼黃素含量極顯著低于野生型果蠅，而其果蠅喋呤含量無顯著差異。scarlet基因的產(chǎn)物負(fù)責(zé)果蠅眼黃素的跨膜運(yùn)輸，研究者在scarlet基因中檢測到了7.5 kb的逆轉(zhuǎn)座子412 元件的插入，他們認(rèn)為果蠅亮紅眼是scarlet基因突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止，其編碼蛋白部分缺失或完全喪失功能,從而引起果蠅眼睛中眼黃素合成水平的降低，使得其呈現(xiàn)亮紅色［2］。逆轉(zhuǎn)座子在果蠅的生命周期中具有活性，同時(shí)還受到一系列環(huán)境和生理因子的調(diào)節(jié)，例如，幽醇類激素、脅迫、cAMP 水平、DNA 損傷因子等。霉菌毒素具有致畸、致癌、致變態(tài)等作用，對于DNA 穩(wěn)定性有較大影響［6］。霉變培養(yǎng)中的霉菌毒素作為果蠅生活的脅迫條件，可能影響果蠅DNA 內(nèi)部逆轉(zhuǎn)座子的活性，進(jìn)而引起果蠅亮紅眼突變的發(fā)生。