惡性實(shí)體腫瘤患者外周血T細(xì)胞中PD-1、LAG-3、TIM-3的表達(dá)情況

袁 園，陳繼中，朱亦林，張 盛，韓興華，潘躍銀

免疫治療是腫瘤治療學(xué)中繼手術(shù)、化療、放療之后另一個(gè)重要的發(fā)展突破口。第一代免疫檢查點(diǎn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)分子4(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4，CTLA-4)、程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death receptor-1，PD-1)、程序性細(xì)胞死亡配體-1(programmed cell death ligand-1，PD-L1)的抑制劑已經(jīng)成為部分晚期腫瘤的治療策略，然而這些藥物僅在少數(shù)患者(20%左右)中有效[1]，這可能與腫瘤細(xì)胞利用了其他抑制性通路來逃逸免疫攻擊有關(guān)。除CTLA-4和PD-1/PD-L1之外，新興免疫檢查點(diǎn)分子如淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3)、具有Ig和ITIM結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT)等不斷涌現(xiàn)[2]。該研究對(duì)惡性實(shí)體腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞亞群及CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞上免疫檢查點(diǎn)PD-1、LAG-3、TIM-3的表達(dá)水平進(jìn)行探究，以期為惡性腫瘤患者的多靶點(diǎn)聯(lián)合免疫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2019年1～12月在銅陵市人民醫(yī)院住院治療的惡性實(shí)體腫瘤患者30例，其中男16例，女14例，年齡范圍47～93歲，中位年齡67(58，74)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確認(rèn)為惡性實(shí)體腫瘤，排除血液系統(tǒng)腫瘤，患者無自身免疫性疾病，近期未進(jìn)行放療或化療，近期無嚴(yán)重病毒、細(xì)菌等病原體感染。另選取15例該院體檢中心的健康體檢者做為健康對(duì)照組，其中男8例，女7例，年齡范圍43～82歲，中位年齡66(56，78)歲，年齡、性別等一般資料與患者組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 樣本來源腫瘤患者和健康體檢者按照常規(guī)診療需要，于清晨空腹?fàn)顟B(tài)用EDTA-K2真空采血管采集靜脈血2～3 ml。待常規(guī)檢測(cè)完成后，利用剩余血樣標(biāo)本進(jìn)行本研究的檢測(cè)。不再單獨(dú)采集患者和健康對(duì)照者血標(biāo)本。

1.3 主要儀器和試劑

1.3.1主要儀器 DxFLEX流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特生物科技有限公司)；TL80-2型醫(yī)用離心機(jī)(江蘇天力醫(yī)療器械有限公司)；QL-901 Vortex渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；IKA移液器(艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司)；BCD-165F冰箱(廣東海信科龍電器股份有限公司)；CytExpert流式分析軟件(貝克曼庫爾特生物科技有限公司)。

1.3.2試劑耗材 Mouse Anti-Human CD3 APC-CyTM7 SK7、CD4 APC-R700 RPA-T4、CD8 RPA-T8 BB515、CD56 APC B159、CD279(PD-1) PE-Cy7 EH12.1、CD223(LAG-3) PE-CF594 T47-530、CD366(TIM-3) PE 7D3均購自美國(guó)BD Biosciences公司；CD19 Monoclonal Antibody(SJ25C1)PerCP-eFluor 710、Flow Cytometry Staining Buffer均購自美國(guó)賽默飛世爾公司；熒光單克隆抗體試劑盒、血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)┚徸员本┩鷷r(shí)代生物技術(shù)公司；Coulter Clenz Cleaning Agent購自貝克曼庫爾特(蘇州)公司；EDTA-K2真空采血管、流式細(xì)胞術(shù)專用試管均購自浙江拱東醫(yī)療器械有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)進(jìn)行檢測(cè)：① 配制1×血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)┕ぷ饕海簩⒃噭┖袃?nèi)10×血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)饪s液取出，按照當(dāng)天的樣本數(shù)量計(jì)算(1 ml/管)用量。使用去離子水將濃縮液按照1 ∶10稀釋成1×血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)┕ぷ饕?，平衡至室溫。?在流式細(xì)胞術(shù)專用試管底部加入抗人CD3(5 μl)、CD4(5 μl)、CD8(5 μl)、CD19(5 μl)、CD56(20 μl)、PD-1(5 μl)、LAG-3(5 μl)和TIM-3(5 μl)熒光標(biāo)記的單克隆抗體，對(duì)照管中加入等量陰性對(duì)照抗體。③ 充分顛倒混勻EDTA-K2抗凝的全血。為了保證吸樣準(zhǔn)確，使用反向移液技術(shù)吸取100 μl抗凝全血，輕輕加入試管底部，注意避免血液碰觸到試管上壁。④ 使用渦旋震蕩器，輕輕渦旋混勻已加入熒光抗體的樣本，20～25 ℃下避光孵育20 min。⑤ 向熒光抗體樣本管中加入1×血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)┕ぷ饕? ml，使用渦旋震蕩器輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育15 min。⑥ 使用移液器向熒光抗體樣本管中加入細(xì)胞染色緩沖液1 ml洗滌，使用離心機(jī)1 500 r/min離心5 min。⑦ 手持流式管，傾倒上清液，然后果斷回正，切勿二次傾倒導(dǎo)致細(xì)胞丟失。此時(shí)流式管底部應(yīng)剩余約200 μl液體，渦旋振蕩器渦旋混勻。⑧ 重復(fù)步驟⑥、⑦。⑨ 向流式樣本管加入500 μl細(xì)胞染色緩沖液，渦旋振蕩器重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。淋巴門內(nèi)至少收集10 000個(gè)細(xì)胞，保存數(shù)據(jù)。使用CytExpert流式分析軟件設(shè)門分析樣本中CD3-、CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4/CD8、B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞上的免疫檢查點(diǎn)分子PD-1、LAG-3、TIM-3的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組和對(duì)照組外周血CD3-、CD3+T細(xì)胞的表達(dá)比例惡性腫瘤患者外周血CD3-細(xì)胞比例(59.55%±21.09%)，與健康對(duì)照組(53.07%±10.43%)相比有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.378，P>0.05)；惡性腫瘤患者外周血CD3+T細(xì)胞比例(40.09%±21.18%)，與健康對(duì)照組(46.78%±10.39%)比較有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.422，P>0.05)；代表性流式圖見圖1。

2.2 腫瘤組和對(duì)照組外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)比例及CD4/CD8比值惡性腫瘤患者外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例(57.64%±15.52%)、(34.03%±14.27%)，與健康對(duì)照組(54.69%±11.33%)、(31.13%±9.97%)比例接近，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.654、-0.704，P>0.05)；惡性腫瘤患者外周血CD4/CD8比值1.94(0.96，2.68)，與健康對(duì)照組比值1.85(1.30，2.67)相比變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.120，P>0.05)；流式代表圖及統(tǒng)計(jì)見圖2。

2.3 腫瘤組和對(duì)照組外周血B細(xì)胞、NK細(xì)胞的表達(dá)比例惡性腫瘤患者外周血B細(xì)胞比例5.90%(3.09%，10.69%)，與健康對(duì)照組7.63%(6.67%，10.85%)相比有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.156，P>0.05)；惡性腫瘤患者外周血NK細(xì)胞比例8.61%(5.58%，16.15%)，與健康對(duì)照組21.96%(12.84%，36.47%)相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.539，P<0.001)；流式代表圖及統(tǒng)計(jì)見圖3。

圖1 腫瘤組和對(duì)照組外周血CD3-、CD3+T細(xì)胞的表達(dá)情況

圖2 腫瘤組和對(duì)照組外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)和CD4/CD8比值情況

圖3 腫瘤組和對(duì)照組外周血B細(xì)胞、NK細(xì)胞的表達(dá)情況

2.4 腫瘤組和對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)PD-1、LAG-3、TIM-3的表達(dá)情況惡性腫瘤患者外周血PD-1+CD4+T細(xì)胞比例8.96%(6.06%，15.34%)，與健康對(duì)照組7.34%(3.94%，8.94%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.119，P<0.05)；惡性腫瘤患者外周血LAG-3+CD4+T細(xì)胞比例15.92%(12.61%，18.64%)，與健康對(duì)照組9.11%(7.93%，10.46%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.021，P<0.001)；惡性腫瘤患者外周血TIM-3+CD4+T細(xì)胞比例14.18%(11.01%，19.50%)，與健康對(duì)照組7.64%(6.51%，10.55%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.466，P<0.001)；代表性流式圖見圖4。

2.5 腫瘤組和對(duì)照組外周血CD8+T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)PD-1、LAG-3、TIM-3的表達(dá)情況惡性腫瘤患者外周血PD-1+CD8+T細(xì)胞比例10.07%(8.49%，12.88%)，與健康對(duì)照組6.71%(5.10%，9.31%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.070，P<0.01)；惡性腫瘤患者外周血LAG-3+CD8+T細(xì)胞比例17.64%(14.27%，20.74%)，與健康對(duì)照組4.09%(2.52%，12.41%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.852，P<0.001)；惡性腫瘤患者外周血TIM-3+CD8+T細(xì)胞比例18.66%(9.09%，23.59%)，與健康對(duì)照組6.60%(5.01%，12.87%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.576，P<0.01)；流式代表圖及統(tǒng)計(jì)見圖5。

2.6 腫瘤組和對(duì)照組外周血雙陽耗竭CD4+T、雙陽耗竭CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況雙陽耗竭CD4+T、雙陽耗竭CD8+T細(xì)胞，即PD-1、LAG-3、TIM-3中兩個(gè)分子陽性的CD4+T和CD8+T細(xì)胞，它們往往代表著T細(xì)胞功能高度抑制，進(jìn)一步失去活性。惡性腫瘤患者外周血PD-1+LAG-3+CD4+T細(xì)胞比例3.03%(1.02%，6.79%)，與健康對(duì)照組2.10%(1.52%，2.67%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.898，P<0.01)；惡性腫瘤患者外周血PD-1+TIM-3+CD4+T細(xì)胞比例2.12%(1.24%，5.58%)，與健康對(duì)照組1.11%(0.73%，1.24%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.389，P<0.001)；惡性腫瘤患者外周血LAG-3+TIM-3+CD4+T細(xì)胞比例2.98%(0.59%，8.19%)，與健康對(duì)照組1.28%(0.80%，1.54%)相比增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.207，P<0.01)；三種表型的雙陽耗竭CD8+T在腫瘤組與健康組中的比例接近，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雙陽耗竭CD4+T細(xì)胞流式代表圖及統(tǒng)計(jì)見圖6。

2.7 惡性腫瘤患者外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞及其免疫檢查點(diǎn)分子PD-1、LAG-3、TIM-3的相關(guān)性分析惡性腫瘤患者外周血CD4+T細(xì)胞與PD-1+CD4+T細(xì)胞比例之間采用Pearson相關(guān)性分析，其余均采用Spearman相關(guān)性分析。腫瘤患者CD4+T細(xì)胞比例與PD-1+CD4+T(r=-0.506，P=0.004)、PD-1+LAG-3+CD4+T(r=-0.606，P<0.001)、PD-1+TIM-3+CD4+T(r=-0.516，P=0.004)、LAG-3+TIM-3+CD4+T(r=-0.581，P<0.001)細(xì)胞比例之間均呈負(fù)相關(guān)性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CD8+T細(xì)胞與各檢查點(diǎn)陽性亞群之間均無相關(guān)性(P>0.05)。見圖7。

圖4 腫瘤組和對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)PD-1、LAG-3、TIM-3的表達(dá)情況

3 討論

T淋巴細(xì)胞以膜標(biāo)志的不同劃分出不同的亞群，CD3分子在抗原識(shí)別中起著信號(hào)傳遞的重要作用，一般僅存在于T細(xì)胞表面；CD4+T細(xì)胞主要通過細(xì)胞因子的作用調(diào)節(jié)T細(xì)胞的亞群分化和B細(xì)胞的抗體分泌；CD8+T細(xì)胞則通過細(xì)胞毒性作用，直接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，CD4/CD8比例穩(wěn)定對(duì)機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)具有重要意義[3]。本研究中惡性實(shí)體瘤患者，與健康對(duì)照組相比，外周血中CD3-細(xì)胞比例有升高趨勢(shì)，CD3+T細(xì)胞、B細(xì)胞比例均呈降低趨勢(shì)，而CD4+T比例、CD8+T細(xì)胞比例及CD4/CD8比值均與健康對(duì)照組相接近。由此提示惡性腫瘤患者的T、B淋巴細(xì)胞活化可能受到抑制，而免疫功能低下與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例的關(guān)系不確切，是否與細(xì)胞數(shù)量和亞群有關(guān)尚待進(jìn)一步研究；NK細(xì)胞因其固有表達(dá)的受體可無需致敏直接識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，是非常重要的固有免疫細(xì)胞。本研究中腫瘤患者的NK細(xì)胞的表達(dá)比例降低，這可導(dǎo)致患者的固有免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力降低，造成腫瘤的發(fā)生和逃逸[4]。

圖5 腫瘤組和對(duì)照組外周血CD8+T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)PD-1、LAG-3、TIM-3的表達(dá)情況

PD-1是重要的抑制性免疫檢查點(diǎn)分子，主要表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞表面，其配體為PD-L1和PD-L2；PD-1與配體結(jié)合后通過多種途徑抑制T、B、NK細(xì)胞活化信號(hào)和細(xì)胞因子的釋放[5]。本研究檢測(cè)了CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞上PD-1分子的表達(dá)率，結(jié)果顯示惡性腫瘤患者與健康對(duì)照組比較外周血PD-1+CD4+T、PD-1+CD8+T細(xì)胞比例均升高，提示腫瘤患者的T淋巴細(xì)胞功能高度抑制，抗腫瘤免疫功能低下。

LAG-3是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)性免疫檢查點(diǎn)分子，與CD4在分子結(jié)構(gòu)上很相似，配體為MHC-Ⅱ分子，主要表達(dá)在活化或耗竭T細(xì)胞、NK等細(xì)胞上[6]；LAG-3主要通過直接抑制T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)Treg細(xì)胞活化增殖，調(diào)節(jié)APC細(xì)胞的功能等方式來發(fā)揮免疫抑制性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)LAG-3不僅可以在腫瘤患者CD4+T和CD8+T細(xì)胞上高表達(dá)，提示LAG-3可能參與了抗腫瘤免疫抑制，而且CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)率高于CD4+T細(xì)胞。Shapiro et al[8]在慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)CD8+T和CD4+T均高表達(dá)LAG-3，且LAG-3+CD8+T的比例高于LAG-3+CD4+T的比例，本研究結(jié)果與之具有一致性。

TIM-3是一種在T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、Treg細(xì)胞、NK細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中均可表達(dá)的負(fù)性免疫檢查點(diǎn)分子，TIM-3與配體結(jié)合可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞功能耗竭，不能活化且不能分泌細(xì)胞因子[7]。本研究中腫瘤患者TIM-3在CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)率均高于健康對(duì)照組，提示TIM-3可能通過抑制T淋巴細(xì)胞亞群導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。

圖6 腫瘤組和對(duì)照組外周血雙陽耗竭CD4+T細(xì)胞的表達(dá)情況

受腫瘤或慢性感染影響，T淋巴細(xì)胞多種免疫檢查點(diǎn)高表達(dá)，細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，細(xì)胞毒性和增殖能力受損，表觀基因組學(xué)改變的現(xiàn)象稱為T細(xì)胞耗竭[9]。本研究進(jìn)一步研究了惡性腫瘤患者與健康對(duì)照組外周血中雙陽耗竭T細(xì)胞的表達(dá)情況，結(jié)果顯示腫瘤患者的PD-1+LAG-3+CD4+T、PD-1+TIM-3+CD4+T、LAG-3+TIM-3+CD4+T細(xì)胞比例均高于對(duì)照組，而雙陽耗竭CD8+T細(xì)胞比例差異不大，提示腫瘤患者CD4+T細(xì)胞功能進(jìn)一步耗竭，免疫活化調(diào)節(jié)功能較差。動(dòng)物黑色素瘤研究[10]表明，耗竭的CD4+T細(xì)胞可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，而逆轉(zhuǎn)耗竭CD4+T細(xì)胞的治療手段對(duì)復(fù)發(fā)性黑色素瘤非常有效。然而CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的耗竭機(jī)制與表型不完全一致[11]，這可能是本研究中CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞未同步呈現(xiàn)雙陽耗竭的原因之一，此外也可能與樣本量不夠大有關(guān)。需要引起注意的是，腫瘤患者TIM-3、PD-1、LAG-3等負(fù)性分子不僅共表達(dá)，同時(shí)也呈現(xiàn)出此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)，有研究[12]表明PD-1單抗治療耐藥患者的TIM-3表達(dá)上調(diào)。了解腫瘤患者耗竭T細(xì)胞的分子表型和產(chǎn)生機(jī)制，對(duì)于更精確的腫瘤免疫治療策略開發(fā)具有重要意義。

圖7 腫瘤患者外周血CD4+T細(xì)胞與PD-1、LAG-3、TIM-3陽性亞群之間的相關(guān)性

本研究對(duì)惡性腫瘤組的淋巴細(xì)胞亞群及免疫檢查點(diǎn)陽性細(xì)胞亞群進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示腫瘤患者CD4+T細(xì)胞比例隨著PD-1+CD4+T細(xì)胞、雙陽耗竭CD4+T細(xì)胞比例的升高而降低，均呈負(fù)相關(guān)性。提示腫瘤患者PD-1、LAG-3、TIM-3高表達(dá)與CD4+T細(xì)胞比例降低相關(guān)，這進(jìn)一步印證了免疫檢查點(diǎn)分子對(duì)T淋巴細(xì)胞活化增殖的負(fù)性調(diào)控作用[5,7]。

綜上，本研究表明惡性實(shí)體腫瘤患者外周血部分淋巴細(xì)胞比例紊亂。負(fù)性免疫檢查點(diǎn)分子高表達(dá)、共表達(dá)，耗竭T細(xì)胞比例升高，對(duì)細(xì)胞免疫進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。免疫檢查點(diǎn)分子的協(xié)同作用可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤患者淋巴細(xì)胞亞群及免疫檢查點(diǎn)水平，對(duì)臨床免疫治療具有重要價(jià)值。腫瘤患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑單藥治療無效的患者，多靶點(diǎn)聯(lián)合治療可能會(huì)取得更好的效果。