尋常型銀屑病表皮細(xì)胞中Sp1的表達(dá)及臨床意義

鐘 維，王冬梅，劉家蕊，朱 磊，黃鈺淇，徐文聰，陳永鋒

銀屑病是一種具有遺傳傾向的炎癥性增殖性皮膚病,以表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖為特征，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes,KC)不僅作為局部免疫反應(yīng)的終末靶細(xì)胞[1], 也是抗原遞呈細(xì)胞，主動(dòng)參與皮損中T細(xì)胞的再活化，目前認(rèn)為與銀屑病發(fā)病密切相關(guān)[2]。轉(zhuǎn)錄因子特殊蛋白1(transcription factors specificity protein 1,Sp1)可特異性識(shí)別并結(jié)合DNA中富含GC序列[3]，其在人體皮膚、子宮等組織內(nèi)呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)，許多管家基因及組織特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)域因富含GC序列而受Sp1調(diào)控[4]，從而參與細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、細(xì)胞周期發(fā)展等生理過(guò)程[5]。Sp1對(duì)KC細(xì)胞功能的影響及其如何參與銀屑病發(fā)病的過(guò)程，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)驗(yàn)證Sp1在銀屑病表皮中的表達(dá)，初步探討Sp1如何調(diào)節(jié)KC細(xì)胞導(dǎo)致銀屑病的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源51例尋常型銀屑病患者均為2018年8月～2019年5月廣東省皮膚病醫(yī)院皮膚科門(mén)診患者，其中男41例，女10例，年齡12～67(47.25±16.6)歲。臨床皮損和病理診斷均符合《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》第二版[6]尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)。收集患者一般資料，評(píng)估皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)，即PASI評(píng)分。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 患有皮肌炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病等自身免疫系統(tǒng)障礙的患者；② 其他對(duì)取材具有迷惑性的慢性皮膚病(如過(guò)敏性皮膚表現(xiàn)、細(xì)菌感染性皮膚病、真菌侵犯性疾病等)；③ 近3個(gè)月接受過(guò)外用中強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素治療(如丙酸氯倍他索乳膏、曲安奈德尿素乳膏等)、光化學(xué)治療[如長(zhǎng)波紫外線(ultraviolet A，UVA)、窄譜中波紫外線(ultraviolet B，UVB)、補(bǔ)骨脂素(psoralen，PUVA)等光照治療]、系統(tǒng)性治療的患者(如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑類(lèi)藥物等)。54例對(duì)照組為廣東省皮膚病醫(yī)院行整形手術(shù)的健康受試者，其中男25例，女29例，年齡12～76(33.88±15.75)歲，兩組間性別及年齡相對(duì)匹配。研究方案根據(jù)赫爾辛基宣言的原則設(shè)計(jì)和實(shí)施，并經(jīng)本院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。在志愿者簽署知情同意書(shū)后對(duì)其進(jìn)行活組織檢查，每人選取1 cm×1 cm皮膚組織。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來(lái)源為人永生化表皮細(xì)胞株Hacat(BNCC100433)(永生化非腫瘤性KC)，購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器兔抗人-Sp1單克隆抗體(一抗)(#9389，1 ∶2 000，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；DAKO酶標(biāo)羊抗兔IgG抗體(二抗)(#ab672，1 ∶5 000，美國(guó)Abcam公司)；GAPDH(#ab37168，1 ∶4 000，美國(guó)Abcam公司)；LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Nano Drop儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)； Light Cycler 480 PCR儀(瑞士Roche公司)；BIO-RAD多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HE染色及免疫組化 取患者皮膚組織制成蠟塊做4 μm切片待用；脫蠟后于3% H2O2染缸內(nèi)室溫孵育10 min，將玻片浸入1×抗原修復(fù)液中加熱20 min；滴加50 μl兔抗人-Sp1抗體(1 ∶100)，4 ℃過(guò)夜孵育；滴加二抗(1 ∶500)，37 ℃水浴20 min；鏡下顯色后復(fù)染3 min；鏡下觀察Sp1蛋白的表達(dá)及分布(按照抗體說(shuō)明書(shū)及文獻(xiàn)，Sp1陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃棕色顆粒狀物質(zhì)沉積)。Sp1蛋白表達(dá)水平以Image J軟件檢測(cè)平均光密度值(average optical density，AOD)表示。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantity polymerase chain reaction，RT-qPCR) ① 提取組織中的總RNA(所有操作冰上進(jìn)行)：組織稱(chēng)重后研磨至粉末狀；加入TRIzol試劑充分裂解；加氯仿萃取，離心20 min后取上清液，并加入等體積異丙醇混勻；再次離心見(jiàn)白色沉淀物即組織總RNA；加入DEPC水溶解RNA沉淀物；用NanoDrop儀檢測(cè)RNA濃度；達(dá)標(biāo)后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；② 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：以GAPDH為內(nèi)參，Sp1前引物：5′-CCTTCAGGGATTTCCAACTG-3′,后引物：5′-GTCCAAAAGGCATCAGGGTA-3′；GAPDH前引物：5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′,后引物：5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT -3′；采用20 μl反應(yīng)體系，在無(wú)RNA酶八聯(lián)管中分別加入10 μl SYBR Prime Ex TaqTM、1 μl cDNA、7 μl DEPC水、前后引物各1 μl，采用BIO-RAD多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，循環(huán)閾值(cycle threshold valve, Ct)值通過(guò)2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算倍數(shù)變化。

1.3.3Western blot 提取組織總蛋白后選擇10% SDS-PAGE膠，加樣后恒壓電泳；轉(zhuǎn)PVDF膜后再次恒流電泳; 取出PVDF膜轉(zhuǎn)至封閉液中浸泡，恒溫37 ℃搖床勻速搖60 min;取膜置于一抗稀釋液(Sp1 1 ∶2 000,GAPDH 1 ∶4 000)中4 ℃冰箱過(guò)夜;次日清洗后浸泡于羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000)中37 ℃搖床孵育60 min;置于暗房用膠片顯影。

1.3.4si-RNA基因敲降技術(shù) 合成即用型化學(xué)合成雙鏈小分子RNA(short interfering RNA，siRNA)：將Hacat細(xì)胞計(jì)數(shù)后按3×104個(gè)/孔鋪板，置于培養(yǎng)箱過(guò)夜使細(xì)胞貼壁后密度達(dá)到50%；使用LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent(#13778150) 按說(shuō)明書(shū)制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物混合液，按比例加入相應(yīng)體積混合液于培養(yǎng)基中；置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～96 h，顯微鏡下觀察Hacat細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以備下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.5絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)法 按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃接種適合數(shù)量的細(xì)胞后行siRNA基因敲降實(shí)驗(yàn)；用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化Hacat細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液；在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞密度：每毫升原液中的細(xì)胞數(shù)=4部分細(xì)胞數(shù)的平均數(shù)×104×稀釋倍數(shù)。通過(guò)比較Sp1敲低組和對(duì)照組之間的細(xì)胞數(shù)目差異值，研究Sp1對(duì)細(xì)胞增殖功能的影響。

1.3.6CCK-8計(jì)數(shù)法 以Hacat細(xì)胞5 000個(gè)/孔鋪96孔板為例：細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，以5 000個(gè)/孔鋪96孔板，每孔約100 μl細(xì)胞懸液；置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜；按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求轉(zhuǎn)染siRNA后置于培養(yǎng)箱48 h；次日每孔加入10 μl CCK-8試劑，嚴(yán)格避光置于培養(yǎng)箱孵育4 h；使用酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)測(cè)定OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)450～490 nm，參比波長(zhǎng)600～650 nm)。

2 結(jié)果

2.1 Sp1蛋白在銀屑病組和對(duì)照組皮組織中的表達(dá)及分布免疫組化染色法定位Sp1在尋常型銀屑病患者皮損中廣泛分布于表皮各層細(xì)胞胞核，以棘層和基底層為主；在對(duì)照組皮膚中主要定位于棘層細(xì)胞胞核中，銀屑病組中染色強(qiáng)度與范圍高于對(duì)照組(圖1)。Sp1的平均光密度值在銀屑病組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=24,P=0.012 7)。見(jiàn)圖2A。

圖1 銀屑病組和對(duì)照組皮組織Sp1的表達(dá)

2.2 Sp1 mRNA水平的表達(dá)RT-qPCR檢測(cè)皮組織中Sp1 mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示Sp1 mRNA在兩組中均有表達(dá)，但尋常型銀屑病組Sp1 mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=25,P=0.005 7)。見(jiàn)圖2B。

2.3 Sp1蛋白水平的表達(dá)Western blot檢測(cè)銀屑病組和對(duì)照組皮組織中Sp1蛋白的表達(dá)差異，結(jié)果表明Sp1 mRNA在兩組中均有表達(dá)，但尋常型銀屑病組Sp1 mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=56,P<0.000 1)。見(jiàn)圖2C、2D。

2.4 細(xì)胞水平驗(yàn)證Sp1的功能由于銀屑病原代KC培養(yǎng)困難，故使用Hacat細(xì)胞系替代(永生化非腫瘤性KC，為目前公認(rèn)可替代KC完成功能實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系)。通過(guò)siRNA基因敲降技術(shù)降低Hacat細(xì)胞Sp1的表達(dá)(圖3A)，并應(yīng)用Western blot檢測(cè)證實(shí)Sp1表達(dá)已被成功敲降，最后采用CCK-8計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量(圖3B)，采用絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)法記錄各組之間Hacat細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(圖3C)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組Hacat細(xì)胞增殖功能受到抑制，Sp1的表達(dá)降低能夠抑制Hacat細(xì)胞的增殖，即反向證明Sp1可影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 Sp1在銀屑病組和對(duì)照組皮組織中的差異性表達(dá)圖示

3 討論

銀屑病是一種多基因參與的紅斑鱗屑性皮膚病，通過(guò)免疫介導(dǎo)的多條通路最終引起KC增殖的慢性炎癥性免疫性疾病。其病理特征為表皮角化過(guò)度和角化不全、棘層增厚、真皮炎癥[7]。銀屑病的發(fā)病機(jī)制累及多環(huán)節(jié)多通路，目前普遍認(rèn)為IFN-γ/TNF-Th1軸在銀屑病的發(fā)病中起重要作用[8]。TNF直接或間接誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，后者通過(guò)與相應(yīng)受體結(jié)合啟動(dòng)3條主要的免疫調(diào)控通路：NF-Kappa B活化和炎癥的產(chǎn)生；MAPK(促分裂元活化蛋白激酶)通路活化KC的分化增殖、細(xì)胞的死亡信號(hào)，從而在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)通過(guò)凋亡和抗凋亡信號(hào)共同調(diào)節(jié)，引起多種調(diào)控KC生長(zhǎng)分化的細(xì)胞因子異常表達(dá)，導(dǎo)致免疫介導(dǎo)下KC過(guò)度增殖最終發(fā)生銀屑病[9]。

圖3 對(duì)照組和敲低Sp1實(shí)驗(yàn)組統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

Sp1是Sp家族的重要成員之一，其成員與3個(gè)相鄰的Cys2His2型鋅指共享高度保守的DBD(序列同一性超過(guò)65%)，因此它們以重疊的特異性和親和力結(jié)合到GC或GT盒上。其成員包括Sp1、Sp3、Sp4，其中Sp1在人體皮膚、子宮等組織內(nèi)呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)，許多管家基因及組織特異性基因的啟動(dòng)子區(qū)域因富含GC序列而受Sp1調(diào)控。其參與細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、細(xì)胞周期發(fā)展、血管生成和轉(zhuǎn)移等生理過(guò)程[10]，是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]。研究[12]表明腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNFα)的表達(dá)可通過(guò)SP家族中Sp1和Sp3相互作用而調(diào)控，尤其是Sp1的正向調(diào)控起主要作用。其在胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等多種腫瘤中特異性高表達(dá)，與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤患者的愈后呈正相關(guān)[13]。目前對(duì)于Sp1在銀屑病中發(fā)揮的作用仍然知之甚少。

本研究免疫組化染色顯示Sp1廣泛表達(dá)于皮膚組織表皮層細(xì)胞胞核，其中尋常型銀屑病皮損中Sp1表達(dá)以棘層和基底層為主，且染色強(qiáng)度與范圍高于對(duì)照組，此層細(xì)胞受參與表皮增殖分化的基因調(diào)控，故明確Sp1與尋常型銀屑病的發(fā)生存在相關(guān)性，可能參與調(diào)控銀屑病表皮異常增殖分化的過(guò)程。為進(jìn)一步探究其在分子水平的表達(dá)，通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)Sp1在mRNA水平和蛋白水平皆有差異性表達(dá)，且尋常型銀屑病皮損中Sp1表達(dá)量高于對(duì)照組，再次從兩方面正向驗(yàn)證Sp1與尋常型銀屑病存在密切的相關(guān)性。為了解Sp1的表達(dá)對(duì)KC功能的影響，反向驗(yàn)證Sp1與銀屑病的關(guān)系，采用siRNA基因敲降技術(shù)抑制Hacat細(xì)胞中Sp1的表達(dá)，結(jié)果表明Sp1的表達(dá)降低能夠抑制Hacat細(xì)胞的增殖。由此證明Sp1與KC增殖功能具有相關(guān)性。結(jié)合文獻(xiàn)，推測(cè)Sp1通過(guò)正向調(diào)控TNFα的表達(dá)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，后者啟動(dòng)3條主要的免疫調(diào)控通路，發(fā)揮IFN-γ/TNF-Th1軸在銀屑病發(fā)病中的重要作用。

綜上所述，本研究豐富了銀屑病發(fā)病機(jī)制的通路，明確了Sp1與銀屑病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性，為日后的研究以Sp1的表達(dá)量作為銀屑病生物學(xué)行為和治療有效性的生物學(xué)指標(biāo)的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和研究方向。近年來(lái)隨著生物制劑靶向藥物的推廣，未來(lái)擬增加動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究Sp1是否在咪喹莫特小鼠銀屑病模型中影響KC的增殖，通過(guò)涂抹型的Sp1抑制劑觀察其對(duì)銀屑病小鼠模型的治療作用，有望為尋常型銀屑病的治療提供新靶點(diǎn)。