BACH1在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

陳 沖，周 波，常家聰

胃癌作為全球第五大高發(fā)癌癥，死亡率位居第三，目前患者的5年生存率依然低下[1]。因此，進(jìn)一步研究胃癌分子機(jī)制并為之提供合理的治療方案迫在眉睫。當(dāng)前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子BACH1(BTB and CNC homology1)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，屬于帽和衣領(lǐng)堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈蛋白家族(cap'n'collar type of basic region leucine zipper protein family，CNC-bZip)，它通過抑制血紅素環(huán)氧化酶1(hemoxygenas-1，HO-1)的表達(dá)在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中起重要作用[2]，越來越多的證據(jù)表明BACH1參與結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等癌癥的發(fā)生、發(fā)展[3-5]。然而國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)BACH1在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理資料相關(guān)性的文獻(xiàn)報(bào)道，因此該研究通過檢測BACH1在胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1胃癌組織芯片及相關(guān)信息 胃癌組織芯片(型號：HStmA180Su15)購自上海芯超生物科技有限公司,包含了手術(shù)時(shí)間為2006年7月～2007年4月共98例胃癌患者癌組織及與其相對應(yīng)的82例癌旁組織，經(jīng)后期實(shí)驗(yàn)觀察排除取材失敗位點(diǎn)，最終納入統(tǒng)計(jì)的為89例胃癌組織和78例癌旁組織，其中癌與癌旁配對共70例。組織芯片制作流程: 在組織數(shù)據(jù)庫中選擇合適的組織病例編號，按照組織病例編號從組織庫中取出組織蠟塊和對應(yīng)的HE染色切片，用組織陣列儀按照陣列設(shè)計(jì)抽提病理蠟塊組織芯并有規(guī)律的排列在空白受體蠟塊上，用全自動(dòng)組織切片機(jī)曝露組織芯后對組織陣列塊進(jìn)行切片，切片裱附在防脫片處理的載玻片上最終形成胃癌組織芯片。胃癌患者年齡：41～84(64.74±10.015)歲。胃癌患者的隨訪情況:采取電話隨訪形式，隨訪截止時(shí)間為2015年7月，隨訪時(shí)間為1個(gè)月～107個(gè)月，中位隨訪時(shí)間43個(gè)月。所有患者術(shù)前均未接受放化療治療。

1.1.2試劑 兔抗人BACH1單克隆抗體(DF8317；1 ∶ 200)、SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、蘇木精染色劑購自合肥摩爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 將組織芯片置于恒溫箱中烘烤脫蠟后置于二甲苯中脫蠟2次；酒精梯度脫水；抗原修復(fù)；阻斷過氧化物酶;山羊血清室溫封閉；封一抗、封HRP標(biāo)記二抗, DAB顯色；蘇木精復(fù)染；自來水分化；中性樹脂封片； 顯微鏡觀察。

1.2.2結(jié)果判讀 由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師通過雙盲法對免疫組化結(jié)果閱片并評分。采取雙評分半定量法評估BACH1的表達(dá)情況，免疫組化結(jié)果評分=著色程度×陽性細(xì)胞百分率，按以下評估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀，陽性細(xì)胞：≤5%計(jì)0分；6%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；≥75%計(jì)4分，最終評分<4分為陰性表達(dá)，≥4分為陽性表達(dá)。著色強(qiáng)度：無陽性染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，3褐色計(jì)3分。最高分12分，4分及以下為低表達(dá)，5分及以上為高表達(dá)[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行組間比較，使用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素分析并繪制生存曲線, 生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn), 預(yù)后評估運(yùn)用COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BACH1在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況BACH1集中表達(dá)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，鏡下觀察為淺黃色至棕黃色沉淀。BACH1在胃癌組織中呈中度表達(dá)或低表達(dá)，在癌旁正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，見圖1，胃癌組BACH1表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 BACH1在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況 ×200

表1 胃癌和癌旁組織中BACH1的表達(dá)情況(n)

2.2 BACH1的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系BACH1的表達(dá)和胃癌的病理分級(P=0.017)、T分期(P=0.038)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.035)和TNM分期(P=0.007)相關(guān)，而和性別、年齡、腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性，見表2。

表2 BACH1表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性(n)

2.3 BACH1表達(dá)與胃癌預(yù)后的相關(guān)性分析使用Kaplan-Meier生存分析法和Log-rank統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析BACH1表達(dá)和胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性并繪制生存曲線圖，結(jié)果顯示BACH1高表達(dá)患者預(yù)后更差(P=0.014),見圖2，然后使用單因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.045)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.001)、TNM分期(P=0.019)及BACH1表達(dá)(P=0.016)可作為胃癌患者預(yù)后的預(yù)測因子,隨即將上述4個(gè)指標(biāo)納入多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示BACH1表達(dá)(P=0.028)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.001)是胃癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3。

3 討論

本研究通過組織芯片技術(shù)，用免疫組化實(shí)驗(yàn)方法檢測胃癌組織 中BACH1的 表達(dá)情況，結(jié)果顯示其在胃癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，并證實(shí)其與胃癌病理分級、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)。為了了解BACH1表達(dá)高低與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，通過Kaplan-Meier單因素生存分析發(fā)現(xiàn)BACH1高表達(dá)胃癌患者預(yù)后較低表達(dá)更差；通過單因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析發(fā)現(xiàn)BACH1表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期均是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，將上述4個(gè)指標(biāo)納入多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析發(fā)現(xiàn)BACH1表達(dá)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。綜合上述結(jié)果考慮BACH1可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展并與不良預(yù)后相關(guān)。

表3 影響胃癌患者預(yù)后的單因素和多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析

圖2 胃癌患者BACH1表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線

細(xì)胞衰老是抑制突變細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，可抑制腫瘤的發(fā)生, p53作為人類癌癥中最常見的抑癌基因之一，其突變引起的編碼蛋白構(gòu)象改變和功能喪失最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[7-8]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子BACH1是氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，其通過抑制血紅素氧合酶1(hemoxygenas-1，HO-1)基因的表達(dá)來增加氧化應(yīng)激，BACH1在p53靶基因的一個(gè)子集上通過招募組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1，HDAC1)后與p53形成復(fù)合物，從而抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激情況下由p53介導(dǎo)的細(xì)胞衰老的過程，因此BACH1作為p53的負(fù)調(diào)控因子，連接了氧代謝和細(xì)胞衰老[9-11]。有學(xué)者證實(shí)BACH1可過表達(dá)競爭性結(jié)合p53從而阻礙其發(fā)揮正常生物學(xué)效應(yīng)使得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤獲得耐藥性[12]。研究[4]表明BACH1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多個(gè)參與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的基因，可以顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。最新研究[5]發(fā)現(xiàn)BACH1可以通過刺激糖酵解的方式促進(jìn)肺癌細(xì)胞糖酵解依賴性轉(zhuǎn)移。以上研究發(fā)現(xiàn)提示BACH1可能通過抑制相關(guān)抑癌基因如p53等和相關(guān)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)基因如HO-1等基因的生物學(xué)活性破壞胃上皮細(xì)胞原有的氧化應(yīng)激、衰老、凋亡機(jī)制的平衡，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促胃癌轉(zhuǎn)移基因，刺激胃癌細(xì)胞活性等機(jī)制參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，該研究揭示了BACH1表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，表明其可能促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展并具有獨(dú)立的預(yù)后意義，因此其有望成為胃癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，然而BACH1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制還不清楚，需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以研究。該研究存在了一些不足之處，包括樣本量太少、無新鮮胃癌標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證、缺乏細(xì)胞水平和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等問題，這正是課題組后期準(zhǔn)備開展的工作。