卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒細(xì)胞抗原片的制備

文 志，周 暢,華 瑋,董凱旋,葉 磊,鄭 豪,徐 涵,王林定

卡波肉瘤皰疹病毒(Kaposi′ssarcoma-associated herpesvirus，KSHV)又被稱之為人類皰疹病毒8型(human herpervirus 8，HHV-8),是在1994年由Chang et al[1]在卡波肉瘤(Ksposi′ssacoma, KS)組織中發(fā)現(xiàn)的，是引起KS的主要病原體[2]。經(jīng)研究證明KSHV同時還是原發(fā)性滲出性淋巴瘤[3](primary effusion lymphoma，PEL)多中心性Castleman病(multicentric Castlemans disease， MCD)的病原體[4]，是危害人類健康的一大病原體。KSHV的生命周期包涵兩個階段，潛伏期和裂解期。潛伏期和裂解期的轉(zhuǎn)換是受到基因的嚴(yán)格控制[5]。潛伏期占病毒整個生命周期的絕大多數(shù)時間，病毒的基因受到嚴(yán)格調(diào)控，只有少數(shù)潛伏相關(guān)基因在持續(xù)表達(dá)，所以臨床很難對這一時間段病毒的存在做出精確的檢出，但在裂解復(fù)制階段，病毒絕大多數(shù)基因復(fù)制表達(dá)，并包裝產(chǎn)生新的病毒，感染新的宿主細(xì)胞。目前用于檢測KSHV的方法主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，時間長，耗材大，不能長久保存。但是目前用只有KSHV感染而EB病毒未感染過的PEL細(xì)胞系來檢測血清樣本尚無人報道。這種細(xì)胞抗原片的制備能很好地解決上述問題，為KSHV的血清檢測提供了一條新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 卡波肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染細(xì)胞系BCBL-1由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑和材料 12孔免疫熒光原位雜交載玻片；Triton X-100(德國Biofrox公司)；DAPI染液、牛血清白蛋白(BSA)(上海碧云天公司)；山羊抗人IgG(FITC) (武漢Elabscience公司)；免疫熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司TH4-200)；KSHV陰性和陽性標(biāo)本為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將BCBL-1細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10% FBS的且含有1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每48 h觀察細(xì)胞狀態(tài)并收集細(xì)胞離心換一次液。

1.2.2固定和預(yù)處理細(xì)胞 待細(xì)胞長到活力旺盛時期，收集細(xì)胞，2 000 r/min離心10 min，PBS洗3遍。洗完后加入200 μl PBS，徹底使細(xì)胞懸浮，使細(xì)胞單個均勻分布。載玻片每孔加入5 μl的細(xì)胞懸液，放置室溫，20～30 min，待干透后每孔加入50 μl 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，10～15 min，PBS洗3遍，每次5 min。固定后每孔加50 μl 3%BSA和0.1% Triton X-100的混合液，封閉細(xì)胞，室溫放置1～2 h，PBS洗3遍，每次5 min。

1.2.3檢測樣本 將待測樣本用PBS按照1 ∶50稀釋，每孔加入50 μl，置于4 ℃，過夜孵育。

1.2.4免疫熒光二抗的孵育 將孵育完檢測血清后的抗原片用PBS洗3遍，每次5 min,每孔加入50 μl預(yù)先用PBS按照1 ∶100稀釋后的熒光二抗，室溫避光孵育1～2 h，PBS洗3遍，每次10 min。

1.2.5細(xì)胞核染色 每個抗原孔內(nèi)加入50 μl DAPI染液，室溫避光5 min，PBS洗3遍，每次10 min。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果BCBL-1細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，生長時間相對較長，需在含有10% FBS和1% 雙抗的1640培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)5～7 d，低倍鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)(圖1A)，待細(xì)胞長滿整個視野時，此時細(xì)胞數(shù)量較多，活力旺盛，適合做免疫熒光。

2.2 細(xì)胞固定結(jié)果待細(xì)胞固定在載玻片后肉眼可在載玻片上觀察看到一層白色薄膜覆蓋在孔底，顯微鏡下可見點狀細(xì)胞分布在視野內(nèi)。見圖1B。

圖1 BCBL-1細(xì)胞培養(yǎng)和12孔免疫熒光原位雜交載玻片

2.3 熒光顯微鏡觀察結(jié)果在熒光顯微鏡下，可以觀察到孵育KSHV陽性血清的樣本，有異硫氰酸(FITC)激發(fā)的綠色熒光。KSHV陰性樣本的血清則沒有看見異硫氰酸激發(fā)的綠色熒光。細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞核染色后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核激發(fā)的藍(lán)色熒光位點與FITC激發(fā)的綠色熒光位點相同。見圖2、3。

2.4 普通人群血清樣本的檢測結(jié)果收集了合肥市238份普通血清標(biāo)本，并用此方法檢測，結(jié)果顯示合肥市普通人群感染KSHV的感染率約為7.6%。見表1。

3 討論

KSHV又稱為卡波肉瘤病相關(guān)皰疹病毒，是DNA雙鏈病毒，屬于γ皰疹病毒的亞科。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的KSHV有4種類型，分別是經(jīng)典型KS、地域型KS、移植型KS和AIDS相關(guān)性KS。KSHV在全世界的分布比較廣泛，集中分布在非洲。部分歐美等地和地中海國家是高發(fā)區(qū)域。隨著世界人口的流動，在中國及日韓和東南亞地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了KSHV的活動跡象。我國對KSHV的研究起步相對較晚[6]，但是有研究[7]表明我國西北地區(qū)KSHV的發(fā)病率明顯較高，且各族之間差異較為顯著。

表1 合肥市238例普通人群KSHV的感染情況

圖2 熒光顯微鏡下觀察KSHV陽性與陰性樣本檢測結(jié)果 ×100

圖3 KSHV陽性標(biāo)本結(jié)果局部放大與細(xì)胞核染色對比

目前常用于檢測KSHV的血清學(xué)方法為ELISA間接法，用此方法檢測血清有以下幾個優(yōu)點：① 適用于大量樣本的檢測，一塊反應(yīng)板至少可以檢測90余份血清標(biāo)本，一次檢測數(shù)塊反應(yīng)板可完成上百個樣本的檢測；② 成本較低，ELISA中各種試劑、耗材及儀器價格相對較低，儲存方便。但是缺點也是十分明顯的：① 費時，包被抗原需4 ℃過夜，第2天檢測血清樣本時，當(dāng)中各種過程所需的時間至少要6 h；② 檢測過程中溫度求高，在檢測樣本時，除洗滌外，所有的過程均需要在37 ℃的環(huán)境中進行，尤其是在酶和底物反應(yīng)時，溫度對最終的OD值影響較大；③ 洗滌不完全時，容易造成背景值的偏高，進而造成假陽性。采用細(xì)胞抗原片的方法檢測血清樣本也有優(yōu)點：① 檢測時間短，抗原片還可以儲存。制作抗原片只需要1 h，檢測樣本需要3 h，制作完成的抗原片可置于-80 ℃保存，待有樣本檢測時可直接取出使用。② 靈敏度較ELISA法高，只有與陽性標(biāo)本中的抗體結(jié)合的熒光二抗能激發(fā)目的熒光，目的熒光的強弱只與激發(fā)光的強弱相關(guān)，不受溫度等因素的影響。但是此種方法也存在不足：① 細(xì)胞生長緩慢，BCBL-1細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，相對于普通的貼壁細(xì)胞生長周期更長。② 要求避光。因為熒光二抗中的熒光物質(zhì)在白光環(huán)境下容易淬滅，所以孵育二抗和在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果時不可過長時間暴露在白光下，進而造成假陰性。③ 費用相對較高，熒光顯微鏡的成本及維護和酶標(biāo)儀表相比較高，不適用于臨床檢測樣本。

KSHV生命周期中包涵兩個階段，即潛伏期及裂解期。當(dāng)病毒侵入宿主細(xì)胞后，經(jīng)過短暫的急性感染，病毒的自身基因激活，在表達(dá)的潛伏核抗原(LANA)的作用下，病毒自身的環(huán)狀DNA分子直接耦聯(lián)到宿主細(xì)胞核的基因組中，病毒進入到潛伏狀態(tài)。此時，病毒的大多數(shù)基因處于沉默狀態(tài)，只有少數(shù)的潛伏相關(guān)基因處于激活狀態(tài)，如ORF73、ORF72和K13等。但是當(dāng)宿主受到外界因素的直接或間接作用，處于免疫功能低下時，病毒潛伏狀態(tài)的一些基因能被重新激活，并進入復(fù)制階段，此時能檢測到多種病毒裂解產(chǎn)物，如病毒復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活因子(RTA)，病毒裂解復(fù)制立早期蛋白(MTA)等。

潛伏期相關(guān)核抗原LANA是一種多功能核蛋白，在病毒的整個生命周期中都持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。LANA有220 ku,是由KSHV的ORF73基因編碼。當(dāng)病毒侵入宿主細(xì)胞并且處于潛伏狀態(tài)時，它對病毒染色質(zhì)的復(fù)制，維持正常結(jié)構(gòu)和協(xié)助KSHV病毒基因組整合到宿主細(xì)胞中，并通過有絲分裂進入子代細(xì)胞中，都發(fā)揮著非常重要的作用。目前已知KSHV的基因組的末端重復(fù)序列(terminal repeats，TRs)包含有一個負(fù)責(zé)DNA復(fù)制起始的順式作用元件(cis-element)。LANA是一種反式作用蛋白，它的氨基末端和羧基末端共同參與并調(diào)節(jié)了其與基因組的TRs的特異性結(jié)合，最終形成一種DNA蛋白質(zhì)復(fù)合體，這種蛋白質(zhì)復(fù)合體來調(diào)節(jié)病毒染色質(zhì)的復(fù)制[8]。LANA是定位于細(xì)胞核中，能夠?qū)⒉《镜幕蚪M與宿主的基因組相互整合并隨著宿主細(xì)胞的有絲分裂進入到子代細(xì)胞中[9]。目前認(rèn)為，甲基化的CPG結(jié)合蛋白MeCP2和DEK蛋白共同作用于LANA，介導(dǎo)了這種作用[10]。近幾年發(fā)現(xiàn)在KSHV潛伏感染的JSC細(xì)胞株中，LANA蛋白與著絲粒蛋白F(CENP-F)共同在著絲粒區(qū)域出現(xiàn)，并且觀察到N端與C端能直接與CENP-F結(jié)合。除此之外，還發(fā)現(xiàn)LANA與另一種著絲粒蛋白Bu1b有關(guān)，Bub1與CENP-F共同形成復(fù)合體并且與LANA相互作用，免疫熒光原位雜交顯示，CENP-F、Bub1、LANA三個蛋白共同介導(dǎo)KSHV基因組附著到宿主細(xì)胞的基因組中[11-12]，實驗通過攜帶有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(shRNA)的慢病毒載體干擾蛋白Bnb1的表達(dá)能顯著降低KSHV基因組的拷貝數(shù)量，但是蛋白CENT-F的去除并未觀察到這一現(xiàn)象[13]，提示LANA可能與多種蛋白相互作用，共同促進了病毒潛伏機制的建立。