AP1S1基因在乳腺癌中的表達(dá)與臨床意義

劉 宇，單本杰，沈國(guó)棟，沈夏波，胡世蓮，潘躍銀

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致腫瘤死亡的主要原因。近年來(lái)的技術(shù)進(jìn)步使得乳腺癌患者的生存期延長(zhǎng)[1]。然而乳腺癌具有高度遺傳異質(zhì)性特征，某些類(lèi)型的乳腺癌細(xì)胞具有高度侵襲轉(zhuǎn)移性[2]，且容易復(fù)發(fā)，造成患者術(shù)后緩解若干年仍可死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，如何早期預(yù)測(cè)患者預(yù)后仍然是急需解決的難題。

銜接因子相關(guān)蛋白復(fù)合體1,σ1 亞基 (AP-1 complex subunit sigma-1A，AP1S1)是屬于接頭蛋白復(fù)合體1(adaptor protein complex 1，AP-1)受體分子上的一種連接蛋白，在高爾基體中參與蛋白質(zhì)分選[3]。AP1S1在皮膚和脊髓發(fā)育中的關(guān)鍵作用，目前已知與AP1S1相關(guān)的疾病包括智力障礙、腸病、耳聾、周?chē)窠?jīng)病、角化病和小矮星綜合征等疾病[4]。AP1S1在腫瘤領(lǐng)域研究較少，尤其與乳腺癌發(fā)生發(fā)展是否有關(guān)還未見(jiàn)報(bào)道，該研究旨在探討AP1S1基因表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本按照安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)方案，收集2005～2016年在本院甲乳外科行乳腺癌根治術(shù)或改良根治術(shù)并且病理診斷明確的蠟塊標(biāo)本組織110例。所有病例都是經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科專(zhuān)業(yè)醫(yī)師診斷，臨床分期是根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)癌癥分期手冊(cè)第7分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株與試劑人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231與SKBR3購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Clark公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司；胰酶消化液、TRIzol試劑購(gòu)自上海生工生物科技有限公司；抗AP1S1抗體購(gòu)自上海Invitrogen公司；總RNA抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Analytik Jena公司；siRNA、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒及熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購(gòu)自上海吉瑪生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息學(xué)分析 利用在線(xiàn)數(shù)據(jù)處理軟件GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)[5]與UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)[6]分析美國(guó)TCGA(the cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)中AP1S1在乳腺癌組與正常對(duì)照組的表達(dá)水平，并且通過(guò)Kaplan-Meier生存分析、Log-Rank檢驗(yàn)AP1S1表達(dá)水平與患者總體生存期(overall survival，OS)和無(wú)病生存期(disease free survival，DFS)的相關(guān)性。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231和SKBR3乳腺癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%～50%。按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配置siRNA-lipo2000混合液，將siRNA-lipo2000混合液加入含有細(xì)胞的400 μl培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻；培養(yǎng)4～6 h后，將孔中含siRNA-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基；將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～96 h；效果檢測(cè)：轉(zhuǎn)染完成后24～72 h均可進(jìn)行siRNA沉默效果檢測(cè)，最佳檢測(cè)時(shí)間與細(xì)胞類(lèi)型、轉(zhuǎn)染試劑、檢測(cè)目的等相關(guān)。RNA水平的檢測(cè)：mRNA是檢測(cè)siRNA沉默效率的最佳指標(biāo)，siRNA轉(zhuǎn)染后24～72 h即可檢測(cè)到靶基因mRNA表達(dá)降低，檢測(cè)方法宜采用qPCR檢測(cè)方法。

1.3.4免疫組化 將石蠟包埋的病例標(biāo)本連續(xù)切片后按免疫組化流程常規(guī)操作，使用抗AP1S1抗體(稀釋比例1 ∶1 000)在4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后使用適當(dāng)?shù)腍RP標(biāo)記二抗孵育1 h，使用DAB溶液著色，最后用蘇木精復(fù)染。組織染色強(qiáng)度采用0、1、2、3計(jì)數(shù)，分別代表不存在、弱、中、強(qiáng)；分布評(píng)分采用陽(yáng)性染色百分比<5%得分為0， 5%～25%得分為1，25%～<50%得分為2，≥50%得分為3；將強(qiáng)度和分布得分的總和用于確定表達(dá)水平，分?jǐn)?shù)1或0表示低表達(dá)，分?jǐn)?shù)≥2表示高表達(dá)。

1.3.5熒光定量PCR 采用TRIzol提取組織和細(xì)胞中的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，然后PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃、8 min預(yù)變性；95 ℃、10 s,65 ℃、18 s，72 ℃、16 s，共40個(gè)循環(huán)，U6作為內(nèi)參。引物如下：AP1S1(F：5′-GGAGCTGATCC ACCGATACG-3′，R：5′-CCTCTTGCAGTAGGTCAGC C-3′)、U6(F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)。

1.3.6Western blot實(shí)驗(yàn) 配膠和上樣電泳：根據(jù)配方配制分離膠，待分離膠凝倒掉ddH2O后，用濾紙條吸干水分。樣品上樣：蛋白樣品臨上樣前高速離心，上樣時(shí)取上清液。80 V電壓跑濃縮膠，120 V跑分離膠。轉(zhuǎn)膜：準(zhǔn)備濾紙10張和PVDF膜1張；配transfer buffer (5 ml 20×transfer buffer，20 ml甲醇，加水至100 ml)；先加入甲醇，放入PVDF膜，浸泡30 s后轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜液中待用。然后將PVDF膜和濾紙?jiān)趖ransfer buffer中浸透。電泳結(jié)束后，在濾紙上再倒少量transfer buffer，然后膜在下、膠在上，放置在濾紙上。在膠上倒少量transfer buffer，設(shè)置12 V、48 min開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。封閉：PVDF膜放入封閉液，4 ℃封閉過(guò)夜。一抗孵育：用PBST稀釋一抗，待封閉完成后，用PBST漂洗2次。孵育抗體：在培養(yǎng)板的板蓋上鋪封口膜，將抗體滴加在封口膜的一端，鑷子取出PVDF膜，PVDF膜一端接觸抗體后，再向膜上加抗體液，水平置于4 ℃冰箱中，孵育過(guò)夜。二抗孵育：按1 ∶2 000的比例稀釋二抗。搖床上PBST洗膜3次，每次10 min。用相同的方法孵育二抗。顯影：Thermo公司Supersignal試劑，A、B 等體積混勻在試管中，滴在PVDF膜上，GE公司Las 4000mini顯影拍照。

1.3.7CCK-8實(shí)驗(yàn) 96 孔板中每孔接種2×103個(gè)SKBR3和MDA-MB-231細(xì)胞，100 μl培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，然后使用AP1S1特異siRNA與對(duì)照分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育2 h后放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm吸光度，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100% 。

1.3.8平板克隆實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染AP1S1特異siRNA與對(duì)照siRNA的MDA-MB-231細(xì)胞株，消化細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別以每皿種植100個(gè)細(xì)胞的密度培養(yǎng)2～3周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，洗滌后加4%多聚甲醛固定15 min，加適量吉姆薩染液10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆。

1.3.9細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染AP1S1特異siRNA與對(duì)照siRNA的MDA-MB-231細(xì)胞株分別接種到6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度約為80%時(shí)，用200 μl無(wú)菌槍頭沿孔中軸線(xiàn)輕輕劃痕，然后用PBS洗滌細(xì)胞2次以除去漂浮細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；分別選擇0、20 h時(shí)間點(diǎn)拍照，觀(guān)察劃痕愈合情況并測(cè)量細(xì)胞遷移距離。

2 結(jié)果

2.1 AP1S1在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)和預(yù)后的相關(guān)性在GEPIA網(wǎng)頁(yè)上在線(xiàn)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中1 085 例乳腺癌組和291例正常對(duì)照組AP1S1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示AP1S1在乳腺癌組的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖1A。隨后利用UCLCAN軟件分析1 097例乳腺癌組和114例正常對(duì)照組中AP1S1的表達(dá)水平，結(jié)果證實(shí)了乳腺癌組中AP1S1表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。根據(jù)AP1S1表達(dá)高低分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌患者的OS和DFS，結(jié)果表明AP1S1高表達(dá)患者的OS與DFS均比低表達(dá)患者縮短(P值分別為0.001 3、0.008 3)(圖1C、1D)。

2.2 AP1S1的表達(dá)與病例參數(shù)的相關(guān)性在UALCAN公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索AP1S1表達(dá)與乳腺癌患者的病理亞型、年齡、腫瘤分期或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，結(jié)果提示AP1S1表達(dá)水平與腫瘤分期相關(guān)，隨著腫瘤分期升高，AP1S1的表達(dá)水平也越高(P<0.05)，但與病理亞型、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 臨床標(biāo)本檢測(cè)AP1S1的表達(dá)水平納入110例乳腺癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示有53例AP1S1高表達(dá)，57例AP1S1低表達(dá)(圖3)；進(jìn)一步把AP1S1表達(dá)與病例參數(shù)聯(lián)系起來(lái)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)AP1S1表達(dá)水平與腫瘤大小及AJCC分級(jí)相關(guān)(P<0.05)，而與年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、雌激素受體(ER)狀態(tài)、孕激素受體(PR)狀態(tài)、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER2)狀態(tài)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 AP1S1表達(dá)下調(diào)會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移使用2種AP1S1siRNA與對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和SKBR3細(xì)胞株。采用qPCR方法驗(yàn)證siRNA轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示：在MDA-MB-231細(xì)胞系中AP1S1平均相對(duì)表達(dá)量為(0.826 7±0.035 1)，siRNA1組平均相對(duì)表達(dá)量為(0.213 3±0.040 4)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.84,P<0.000 1)；siRNA2組中平均相對(duì)表達(dá)量為(0.320 0±0.030 0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.00,P<0.000 1)。在SKBR3細(xì)胞系中AP1S1平均相對(duì)表達(dá)量為(0.7567±0.035 1)，siRNA1組中AP1S1平均相對(duì)表達(dá)量為(0.233 3±0.040 4)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.93,P<0.000 1)；siRNA2組AP1S1平均相對(duì)表達(dá)量為(0.430 0±0.040 0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.63,P=0.000 4)(圖4A)。利用Western blot驗(yàn)證siRNA1處理MDA-MB-231和SKBR3細(xì)胞株AP1S1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示使用siRNA1處理的兩種細(xì)胞株的AP1S1蛋白表達(dá)水平均降低(圖4B)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示2種AP1S1 siRNA處理的MDA-MB-231和SKBR3細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞的增殖速率均降低(圖4C)。平板克隆結(jié)果顯示AP1S1siRNA1組的MDA-MB-231和SKBR3細(xì)胞較對(duì)照NC組的克隆數(shù)減小(圖4D)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MDA-MB-231平均遷移距離為(169.00±17.06)mm,siRNA1組平均遷移距離為(80.67±14.64)mm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.806,P=0.002)；SKBR3平均遷移距離為(150.67±13.05)mm，siRNA1組平均遷移距離為(82.67±9.71)mm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.240,P=0.002)(圖4E)。

圖1 公開(kāi)數(shù)據(jù)分析顯示AP1S1在乳腺癌組織中表達(dá)升高

圖2 乳腺癌臨床特征與AP1S1表達(dá)水平的關(guān)系

圖3 臨床標(biāo)本分析AP1S1在乳腺癌組織中的表達(dá)

3 討論

近20年來(lái)，以手術(shù)為主要治療方法，化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療為輔助的多學(xué)科綜合治療模式得到了長(zhǎng)足的發(fā)展[7]，但是長(zhǎng)期以來(lái)缺乏有效的預(yù)后預(yù)測(cè)手段來(lái)指導(dǎo)患者個(gè)體化治療，以至于相當(dāng)一部分化療獲益較少的低風(fēng)險(xiǎn)患者也不得不接受化療。所以研究人員開(kāi)展了多基因檢測(cè)技術(shù)，用來(lái)評(píng)估患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和輔助化療獲益程度，并且多基因檢測(cè)技術(shù)可以進(jìn)一步提高傳統(tǒng)的病理分型和免疫組化分型的預(yù)測(cè)價(jià)值，在提供預(yù)后信息、判斷藥物治療敏感性方面具有非常大的發(fā)展空間[8]。但是這些基因?qū)τ诨颊叩纳骖A(yù)后并不完善，需要我們提供更多的與預(yù)后有關(guān)的基因。因此通過(guò)生物信息學(xué)篩選出了AP1S1這個(gè)與生存預(yù)后有著密切關(guān)系的基因。

圖4 AP1S1表達(dá)下調(diào)會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移

表1 AP1S1表達(dá)與乳腺癌病例參數(shù)的關(guān)系

有關(guān)AP1S1在腫瘤領(lǐng)域的研究尚不多見(jiàn)，有報(bào)道AP1S1可能成為急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)和前列腺癌的癌基因表達(dá)和DNA甲基化狀態(tài)的綜合標(biāo)志物[9]，也可能通過(guò)上調(diào)ERBB2與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)發(fā)生發(fā)展，同時(shí)高表達(dá)水平的AP1S1會(huì)預(yù)示GBM患者的OS較短[10]。鑒于A(yíng)P1S1在乳腺癌中的表達(dá)與生物學(xué)功能尚不清楚，本研究首先通過(guò)GEPIA和UALCAN在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析AP1S1在腫瘤組織與正常對(duì)照組織表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示AP1S1在乳腺癌組織中呈高表達(dá)。進(jìn)一步利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析AP1S1表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性，顯示腫瘤分期越晚，其AP1S1表達(dá)水平越高；通過(guò)GEPIA在線(xiàn)分析顯示AP1S1高表達(dá)乳腺癌患者的OS與DFS也下降。為驗(yàn)證上述結(jié)果，使用臨床病理標(biāo)本分析證實(shí)了AP1S1表達(dá)水平與乳腺癌腫瘤大小及病理分期呈正相關(guān)(P<0.05)。為了解AP1S1基因表達(dá)的生物學(xué)意義，使用siRNA技術(shù)下調(diào)MDA-MB-231和SKBR3 細(xì)胞株AP1S1的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞平板克隆與CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞的AP1S1表達(dá)下調(diào)后，其增殖與克隆形成速度均降低；接著采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AP1S1表達(dá)敲低對(duì)MDA-MB-231和SKBR3細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果表明AP1S1表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的遷移能力降低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AP1S1對(duì)于乳腺癌應(yīng)該是一種促癌基因和患者預(yù)后不良因素。其中AP1S1表達(dá)的臨床意義及其促癌的分子機(jī)制需要更深入的研究。

綜上，本研究表明AP1S1基因在乳腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)；而且AP1S1基因表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成與遷移能力。