槲皮素通過調(diào)控CLDN6基因表達量對子宮內(nèi)膜異位癥細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制研究

黃山鷹，唐國玲，王佳慧，姚秀華，劉 剴，羅智華，劉慶芝

子宮內(nèi)膜異位癥是臨床常見婦科疾病且育齡女性的發(fā)病率較高，應(yīng)用傳統(tǒng)藥物治療子宮內(nèi)膜異位癥效果不佳，患者不良反應(yīng)較多[1-2]。研究[3]表明槲皮素(quercetin，Que)對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的異位內(nèi)膜具有抑制作用。緊密連接蛋白 6(claudin 6，CLDN6)在子宮內(nèi)膜癌中高表達，抑制其表達可以降低子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和遷移[4-5]。Periostin及大黃素可以調(diào)控子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的增殖、黏附力以及遷移和侵襲能力[6]。研究[7]表明通過構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥體外細胞共培養(yǎng)模型有助于研究細胞遷移和侵襲等行為變化。該研究通過分離培養(yǎng)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(ectopic endometrial stromal cells, EcSCs)分析Que對EcSCs增殖、遷移及侵襲的影響，探討其是否可通過調(diào)控CLDN6表達而發(fā)揮作用，為Que治療子宮內(nèi)膜異位癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑Que購自中國食品藥品檢定研究院；DMEM購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；青霉素-鏈霉素混合溶液與ECL發(fā)光液均購自美國Millipore公司；兔抗人Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、磷酸化蛋白激酶B(phospho-AKT，p-AKT)、總蛋白激酶B(total-AKT，t-AKT)、整合素連接激酶 (integrin-linked kinase, ILK)、基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP) -2、MMP-9、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自美國PALL公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；siRNA-CLDN6及其陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MTT試劑與DMSO均購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning Coster公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1病例資料 選取2016年7月～2017年3月本院收治的40例子宮內(nèi)膜異位癥患者，所有患者均進行腹腔鏡或?qū)m腹腔鏡檢查，并經(jīng)手術(shù)病理確診為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者及家屬知情且簽署同意書。入選標準：年齡25～50歲；月經(jīng)規(guī)律；無性激素相關(guān)疾??；術(shù)前均未服用避孕藥等藥物。排除標準：合并惡性腫瘤者；術(shù)前接受性激素治療者?；顧z時切取異位子宮內(nèi)膜組織，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.2.2EcSCs分離與培養(yǎng) 預(yù)冷PBS緩沖液沖洗異位子宮內(nèi)膜組織，加入Ⅳ型膠原酶溶液后剪碎組織，放入37 ℃恒溫振蕩器內(nèi)振蕩消化組織，收集消化后的內(nèi)膜組織置于離心管內(nèi)，用200目篩網(wǎng)過濾，反復(fù)研磨沖洗后離心，制備細胞懸浮液，重懸后的細胞用400目篩網(wǎng)重新過濾，收集濾液并離心(1 000 r/min、10 min)，離心后加入含有10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，將重懸細胞接種于另一培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，并置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，鑒定EcSCs。待EcSCs生長融合度達到80%～90%時棄培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，預(yù)冷PBS緩沖液沖洗2次×5 min，加入胰蛋白酶消化細胞，當細胞收縮變圓時加入DMEM完全培養(yǎng)基消化，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)液，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待細胞穩(wěn)定傳代2次后收集細胞進行后續(xù)研究。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染、Que處理及分組 將EcSCs細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，使用不同濃度Que處理EcSCs細胞，劑量分別為0、12.5、25、50 μmol/L，并篩選出Que適宜使用濃度用于后續(xù)研究。EcSCs生長融合度達到30%時進行轉(zhuǎn)染，分別將空白質(zhì)粒(normal control，NC)、陰性對照質(zhì)粒(si-control)、siRNA-CLDN6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EcSCs，觀察CLDN6表達變化對EcSCs生物學行為的影響。后續(xù)實驗中為明確Que是否通過抑制CLDN6而影響EcSCs生物學行為，實驗分為4組：NC組：未進行任何處理的EcSCs；Que組：EcSCs中加入適宜濃度的Que 作用24 h；Que+pcDNA組：EcSCs中轉(zhuǎn)染pcDNA質(zhì)粒12 h后加入適宜濃度的Que作用24 h；Que+pcDNA-CLDN6組：EcSCs中轉(zhuǎn)染pcDNA-CLDN6質(zhì)粒12 h后加入適宜濃度的Que作用24 h。轉(zhuǎn)染6 h后將不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基更換為含有10%FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.4Western blot檢測CLDN6、PCNA、MMP-2、MMP-9、上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchy-mal transition，EMT)及ILK信號通路相關(guān)蛋白表達 收集各組EcSCs，加入1 ml蛋白裂解液，經(jīng)12 000 r/ min離心20 min提取細胞總蛋白，加入buffer使蛋白變性，取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃條件下孵育各蛋白一抗(CLDN6、PCNA、MMP-2、MMP-9稀釋比1 ∶1 000)24 h，TBST洗滌4次×5 min，加入二抗(稀釋比1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次×5 min，滴加ECL顯色，置于成像系統(tǒng)并用Image J軟件分析各條帶灰度值，同時以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值為衡量標準，分析樣品中CLDN6、PCNA、MMP-2、MMP-9、EMT及ILK信號通路相關(guān)蛋白的相對表達量。

1.2.5MTT檢測EcSCs細胞增殖活性 收集對數(shù)生長期EcSCs，胰蛋白酶消化后調(diào)整細胞密度為5×104個細胞/ml，以每孔體積100 μl接種于96孔板，Que分別干預(yù)24、48、72 h時每孔加入20 μl MTT溶液，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，加入DMSO(150 μl/孔)，振蕩混勻10 min，選取490 nm波長應(yīng)用酶標儀檢測各孔光密度(optical density，OD)值。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞遷移 收集各組EcSCs，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，取200 μl細胞懸液接種于Transwell小室的上室(2×105個細胞/孔)，同時取600 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫溶液染色15 min，收集Transwell小室的下室內(nèi)穿膜細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野計算穿膜細胞數(shù)。實驗均設(shè)置3次生物學重復(fù)。

1.2.7Transwell實驗檢測細胞侵襲 Matrigel基質(zhì)膠稀釋后鋪于Transwell小室底部的上室面，各組EcSCs細胞接種于Transwell小室的上室，Transwell小室的下室中加入含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其余步驟同細胞遷移實驗，顯微鏡下觀察侵襲細胞個數(shù)。實驗均設(shè)置3次生物學重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的Que對EcSCs增殖、增殖相關(guān)蛋白和CLDN6蛋白表達的影響用不同濃度(0、12.5、25、50 μmol/L)Que處理EcSCs，隨著藥物濃度的增加細胞增殖活性降低，與0 μmol/L相比，Que濃度為12.5、25、50 μmol/L時細胞增殖活性降低(P<0.05)；與12.5 μmol/L相比，Que濃度為25、50 μmol/L時細胞增殖活性降低(P<0.05)。見圖1A。Western blot檢測細胞增殖相關(guān)蛋白及CLDN6蛋白表達，結(jié)果顯示隨著Que濃度的增加，與0 μmol/L相比，PCNA與CLDN6蛋白表達均降低(P<0.05)，與12.5 μmol/L比較，PCNA與CLDN6蛋白表達均降低(P<0.05)，且呈劑量依賴效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖1B、1C。

2.2 不同濃度的Que對EcSCs遷移和侵襲的影響用不同濃度Que處理EcSCs細胞，通過Transwell遷移及侵襲實驗檢測EcSCs遷移及侵襲能力變化，結(jié)果顯示(圖2A、2B)，與0 μmol/L相比，Que不同濃度組EcSCs遷移及侵襲細胞數(shù)均減少(P<0.05)；與12.5 μmol/L相比，Que濃度為25、50 μmol/L時EcSCs遷移及侵襲細胞數(shù)均減少(P<0.05)，而25 μmol/L與50 μmol/L比較無明顯差異，由此本研究后續(xù)實驗選用Que濃度為12.5 μmol/L處理EcSCs。Western blot檢測結(jié)果顯示隨著Que使用劑量的增加，與0 μmol/L相比較，MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2C、2D。

圖1 不同濃度Que對EcSCs增殖、增殖相關(guān)蛋白和CLDN6蛋白表達的影響

圖2 不同濃度Que抑制EcSCs遷移和侵襲

2.3 沉默CLDN6對EcSCs增殖、遷移和侵襲的影響通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默CLDN6表達并分析其對EcSCs增殖、遷移和侵襲的影響。Western blot檢測結(jié)果顯示si-CLDN6組EcSCs中CLDN6表達水平低于NC組、si-control組(P<0.05)，NC組與si-control組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NC組、si-control組比較，si-CLDN6組EcSCs增殖活性降低(P<0.05)；與NC組、si-control組比較，si-CLDN6組遷移及侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05)，PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖3。表明沉默CLDN6后能夠抑制EcSCs增殖、遷移及侵襲。

圖3 沉默CLDN6抑制EcSCs增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 過表達CLDN6與Que對EcSCs增殖、遷移和侵襲的影響為探究Que是否通過抑制CLDN6表達而影響EcSCs增殖、遷移及侵襲，通過構(gòu)建CLDN6過表達載體并轉(zhuǎn)染EcSCs，隨后使用Que處理細胞，結(jié)果顯示，相較于Que+pcDNA組，Que+pcDNA-CLDN6組EcSCs增殖活性升高(F72h=63.128，P<0.05)，遷移及侵襲細胞數(shù)均增加(P<0.05)，PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖4。表明CLDN6可逆轉(zhuǎn)Que對EcSCs增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

2.5 過表達CLDN6與Que對EcSCs中EMT發(fā)生的影響為探究Que影響EcSCs遷移及侵襲的作用機制，通過Western blot方法檢測EcSCs中EMT相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示(圖5)，Que處理EcSCs后E-cadherin蛋白表達水平升高(FE-cadherin=7.032，P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平降低(FN-cadherin=21.236，F(xiàn)Vimentin=16.665，P<0.05)，表明Que可抑制EcSCs細胞EMT轉(zhuǎn)化進程。上調(diào)CLDN6表達后Que+pcDNA-CLDN6組EcSCs細胞E-cadherin蛋白表達水平(0.350±0.050)降低(P<0.05)，而N-cadherin(0.550±0.050)、Vimentin(0.740±0.080)蛋白表達水平升高(P<0.05)。表明CLDN6過表達可逆轉(zhuǎn)Que對EcSCs細胞EMT發(fā)生的抑制作用。

2.6 過表達CLDN6與Que對EcSCs中ILK信號通路的影響探究Que對ILK信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Que處理后EcSCs中ILK、p-AKT表達水平均降低(FILK=16.405，F(xiàn)p-AKT=28.090，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，表明Que可抑制ILK信號通路。過表達CLDN6后發(fā)現(xiàn)EcSCs中ILK(0.350±0.050)、p-AKT(0.550±0.050)表達水平較Que+pcDNA組(0.170±0.060；0.320±0.080)升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，而各組間t-AKT表達水平(0.810±0.050；0.830±0.050；0.852±0.050；0.840±0.080)均無明顯差異性(FAKT=0.252，P>0.05)。見圖6。

圖4 過表達CLDN6逆轉(zhuǎn)Que處理EcSCs增殖、遷移和侵襲的抑制作用

圖5 過表達CLDN6與Que對EcSCs中EMT發(fā)生的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥具有極強的侵襲性與復(fù)發(fā)性，導(dǎo)致其成為臨床治療難點問題[8-9]。普通藥物治療可在一定程度上緩解疼痛但其副作用較多[10]。因此，尋找不良反應(yīng)小且可明顯降低雌激素水平的藥物成為臨床治療的重要突破口。

Que還可通過下調(diào)MMP-2、MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶表達進而抑制乳腺癌細胞遷移及侵襲能力[11]。研究[12]指出Que可通過抑制PI3K / AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進而抑制EMT過程。本研究用不同濃度Que處理EcSCs細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著Que使用劑量的增加，EcSCs細胞增殖活性降低，PCNA表達明顯下調(diào)。本研究結(jié)果提示Que可能通過抑制PCNA表達而抑制新生血管生成進而抑制子宮異位內(nèi)膜細胞增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Que處理EcSCs細胞后細胞遷移及侵襲細胞數(shù)均明顯減少，并可抑制MMP-2、MMP-9蛋白表達，提示Que可能通過抑制MMP-2、MMP-9蛋白表達進而抑制EcSCs細胞遷移及侵襲。

圖6 過表達CLDN6與Que對EcSCs中ILK信號通路的影響

CLDN6作為緊密連接蛋白家族成員可在細胞連接及上皮組織通透性等方面均可發(fā)揮重要作用，研究[13-14]表明CLDN6異常表達可參與乳腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程，通過抑制CLDN6表達可抑制乳腺癌細胞遷移及侵襲。本研究結(jié)果顯示沉默CLDN6表達后EcSCs細胞增殖、遷移及侵襲能力降低，PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平下降，說明沉默CLDN6表達可抑制EcSCs細胞增殖、遷移及侵襲。提示CLDN6基因可能作為治療子宮內(nèi)膜異位癥的潛在靶點。為驗證Que是否可通過抑制CLDN6表達而抑制EcSCs細胞增殖、遷移及侵襲，本研究構(gòu)建CLDN6過表達載體轉(zhuǎn)染入EcSCs細胞，使用Que處理后發(fā)現(xiàn)EcSCs細胞增殖、遷移及侵襲能力均相對增強，提示Que可通過抑制CLDN6表達而減弱EcSCs細胞增殖、遷移及侵襲能力，最終達到治療目的。本研究結(jié)果顯示Que處理EcSCs細胞后E-cadherin表達升高，而N-cadherin、Vimentin表達降低，說明Que可通過抑制EMT轉(zhuǎn)化過程而減少異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞進而抑制子宮內(nèi)膜異位癥進展過程。同時CLDN6過表達后EcSCs細胞E-cadherin表達降低，而N-cadherin、Vimentin表達升高，說明CLDN6過表達可促進EMT進程進而促進子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)展。提示Que可抑制CLDN6表達并通過抑制EMT轉(zhuǎn)化進而減緩子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生及發(fā)展。Zheng et al[15]研究表明ILK信號通路可通過促進EMT轉(zhuǎn)換進而增強人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果表明Que處理EcSCs細胞后ILK、p-AKT蛋白表達均降低，說明Que可抑制EcSCs細胞ILK信號通路激活進而抑制EMT轉(zhuǎn)換過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)CLDN6表達后ILK、p-AKT蛋白表達均升高，說明上調(diào)CLDN6表達可激活I(lǐng)LK信號通路激活進而促進EMT轉(zhuǎn)換過程。本研究結(jié)果提示Que可抑制CLDN6表達并通過抑制ILK信號通路進而抑制EMT轉(zhuǎn)換過程最終抑制EcSCs細胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，Que對EcSCs細胞增殖、遷移及侵襲具有抑制作用，其作用機制為通過下調(diào)CLDN6表達，抑制ILK信號通路及EMT轉(zhuǎn)換過程而發(fā)揮作用，Que有望成為治療子宮內(nèi)膜異位癥的理想新藥。但子宮內(nèi)膜異位癥患者臨床服用效果及其在體內(nèi)實驗中的作用效果是否一致均需進一步證實。